M1- ja M2-makrofagien arviointi endometrioosista kärsivien naisten endometrioosikudoksessa eri vaiheissa.

Tausta ja perustelut: Endometrioosi on estrogeenista riippuvainen sairaus, jonka määrittelee kohdunontelon ulkopuolella olevan toiminnallisen kohdun limakalvokudoksen, rauhasten ja strooman ektooppinen läsnäolo ja kasvu (Kavoussi et al, 2016). Endometrioosin etiopatogeneesi on edelleen kiistanalainen: immuuni-, hormonaaliset, geneettiset ja epigeneettiset tekijät voivat olla kaikki mukana, ja useita teorioita on ehdotettu selittämään sitä.

Tauti vaikuttaa 2-10 %:iin lisääntymisikäisistä naisista ja 50 %:iin hedelmättömistä naisista (Dunselman et al, 2014) ja voi aiheuttaa lantion kipua (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), epänormaalia verenvuotoa, hedelmättömyyttä/steriiliteettiä. ja näin ollen tärkeitä psykologisia ongelmia (Laganà et al, 2015). Endometrioosi luokitellaan kohdun limakalvon implanttien, plakkien, endometrioomien ja/tai kiinnikkeiden lukumäärän, koon ja pinnallisen ja/tai syvän sijainnin mukaan. Eniten käytetyn endometrioosiluokituksen on kehittänyt American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), vaikka toista luokittelua voidaan käyttää syvälle tunkeutuvaan endometrioosiin (Haas et al, 2011) tai korreloimaan endometrioosia ja hedelmättömyyttä (Adamson et al, 2010).

Kuten laajalti on todistettu (Donnez et al, 2016), on yleisesti hyväksyttyä, että kohtalainen/vaikea endometrioosiin liittyvä hedelmättömyys johtuu mekaanisista tekijöistä, nimittäin lantion säännöllisen anatomian vääristymisestä/subversiosta. Päinvastoin, hedelmättömyyden/subfertiliteetin taustalla olevat tekijät, jotka liittyvät minimaaliseen/lievään endometrioosiin, ovat vähemmän selviä. Kuitenkaan tähän mennessä mikään oletetuista mekanismeista ei ole tyhjentävästi selittänyt endometrioosiin liittyvää hedelmättömyyttä, vaikka on mahdollista, että tällainen sairaus johtuu useista tekijöistä, mukaan lukien geneettiset ja epigeneettiset modifikaatiot (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Kertyvä näyttö (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) viittaa siihen, että endometrioosista kärsivien naisten vatsakalvon mikroympäristössä tapahtuu useita paikallisia tulehduksellisia ja korjaavia ilmiöitä, joihin osallistuvat paikalliset makrofagit ja perifeeristen mononukleaarien houkutteleminen ja värvääminen. solut (monosyytit ja lymfosyytit) verestä vatsaonteloon: endometrioosin aikana tapahtuu kohdun limakalvon ja vatsakalvon homeostaasin hajoaminen, joka johtuu sytokiinien ohjaamasta solujen lisääntymisestä (Pizzo et al, 2002) ja apoptoosin säätelyhäiriöstä (Sturlese et al, 2011; et al, 2015).

Monosyyteillä on avainrooli adaptiivisen immuniteetin aikana, koska ne vaeltavat infektio- tai tulehduskohdissa, erilaistuvat makrofageissa ja toimivat antigeeniä esittelevinä soluina (APC).

Siitä lähtien, kun Elie Metchnikoff tunnisti ensimmäisen fagosytoosin Messinassa (JAMA, 1968), meritähtien toukilla tehtyjen kokeiden jälkeen monet askeleet eteenpäin mahdollistivat meille laajan yleiskuvan makrofageista lukuun ottamatta niiden roolia fagosyyttisinä soluina.

Ympäröivä mikroympäristö voi vaikuttaa makrofagien plastisuuteen kohti ohimenevää ja palautuvaa polarisaatiota. Nämä polarisoidut fenotyypit heijastavat proinflammatorista tai anti-inflammatorista tilaa ja voivat muuttua ajan myötä. Ne voitaisiin toiminnallisesti luokitella kahteen pääpopulaatioon: "klassisesti aktivoidut" makrofagit (M1) ja "vaihtoehtoisesti aktivoidut" makrofagit (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Vaikka on laajalti hyväksyttyä, että M1 ja M2 edustavat kahta päätepistettä makrofagien aktivaation täydestä spektristä (Liu et al, 2014), viimeaikaiset tiedot (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) saa luonnehtia näitä kahta populaatiota seuraavasti:

• M1-makrofagit: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2-makrofagit: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Tutkimuspopulaatio: Tutkijat valitsevat potilaat, joilla on histologisesti vahvistettu endometrioosi (tapaukset) ja munasarjojen toiminnalliset kystat (kontrollit), joille tehdään laparoskooppinen leikkaus. Endometrioosin tarkistetun American Society for Reproductive Medicine -luokituksen (Rock JA, 1995) mukaisesti endometrioosipotilaat jaetaan neljään ryhmään: endometrioosin minimaaliset, lievät, keskivaikeat ja vaikeat vaiheet.

Kaikki laparoskooppiset toimenpiteet suoritetaan kuukautiskierron proliferatiivisen vaiheen aikana. Tutkijat jättävät tutkimuksen ulkopuolelle naiset, joilla on muita lantion sairauksia, krooninen verenkierto-, autoimmuunisairaus tai kasvainsairaus ja jotka ovat käyttäneet tulehduskipulääkettä tai hormonaalista tai immunomoduloivaa lääkitystä edellisen 6 kuukauden aikana.

Kudosnäytteiden valmistus ja makrofagien karakterisointi: Kudosleikkeet (endometrioottiset kudokset tapauksille, munasarjojen toiminnalliset kystat kontrolleille) jauhetaan ja inkuboidaan entsyymicocktailissa, joka sisältää lopulliset pitoisuudet 3,4 mg/ml pankreatiinia, 0,1 mg/ml hyaluronidaasia ja 1,6 mg/ml kollagenaasi I Hankin puskuroidussa suolaliuoksessa (HBSS), joka sisälsi 2 mg/ml D-glukoosia 37 °C:ssa 2 tunnin ajan. Digestoinnin jälkeen solut dispergoidaan siivilöimällä 250 μm:n seulan läpi ja pestään HBSS:llä. Kudossolut värjätään ja kiinnitetään virtaussytometristä analyysiä varten. Ennen makrofagien eristämistä kuolleet solut poistetaan viljelmästä käyttämällä kuolleiden solujen poistopakkausta. Solujen elinkelpoisuus arvioidaan trypaaninsinisellä poissulkemisella.

Makrofagimarkkerien pintaekspression arvioimiseksi kudosnäytteet värjätään virtaussytometriaa varten fluorokromikonjugoiduilla monoklonaalisilla vasta-aineilla CD14-, CD68-, CCR7- ja CD80-vasta-aineilla M1:n tunnistamiseksi, kun taas fluorokromikonjugoidut monoklonaaliset vasta-aineet CD14-, CD38- ja CD22-, CD0-vasta-aineilla. M2.

Tilastollinen analyysi: Jatkuvien muuttujien normaalijakauman oletus testataan Kolmogorov-Smirnov-testillä sopivuuden suhteen. Kaikki päättelyanalyysit suoritetaan käyttämällä ei-parametrisia tilastollisia testejä. Ryhmien välisiä ei-normaalijakautuneita muuttujia verrataan Kruskal-Wallis-testillä. Tilastollisen merkitsevyyden alue on P < ,05. Lisäksi tutkijat käyttävät useita post hoc -vertailutestejä joko verrokkeihin tai kuhunkin vaiheeseen tietojen analysointiin.