Hodnocení M1 a M2 makrofágů v endometriotické tkáni žen postižených endometriózou v různých stádiích.

Pozadí a zdůvodnění: Endometrióza je estrogen-dependentní onemocnění definované ektopickou přítomností a růstem funkční endometriální tkáně, žláz a stromatu mimo děložní dutinu (Kavoussi et al, 2016). Etiopatogeneze endometriózy stále zůstává kontroverzní: mohou se na ní podílet imunitní, hormonální, genetické a epigenetické faktory a pro její vysvětlení bylo navrženo několik teorií.

Onemocnění postihuje 2–10 % žen v reprodukčním věku a 50 % žen neplodných (Dunselman et al, 2014) a může způsobit pánevní bolesti (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), abnormální krvácení, neplodnost/sterilitu a následně i důležité psychické problémy (Laganà et al, 2015). Endometrióza je klasifikována v závislosti na počtu, velikosti a povrchové a/nebo hluboké lokalizaci endometriálních implantátů, plaků, endometriomů a/nebo adhezí. Nejpoužívanější klasifikaci endometriózy vyvinula Americká společnost pro reprodukční medicínu (Rock JA, 1995), i když pro hlubokou infiltrující endometriózu lze použít i jinou klasifikaci (Haas et al, 2011) nebo pro korelaci endometriózy a neplodnosti (Adamson et al. 2010).

Jak je široce prokázáno (Donnez et al, 2016), je obecně přijímáno, že středně závažná/závažná sterilita související s endometriózou je způsobena mechanickými faktory, jmenovitě distorzí/subverzí pravidelné anatomie pánve. Naopak méně jasné jsou faktory za neplodností/subfertilitou související s minimální/mírnou endometriózou. Nicméně dosud žádný z předpokládaných mechanismů nevysvětlil vyčerpávajícím způsobem neplodnost související s endometriózou, i když je možné, že toto onemocnění je způsobeno více faktory, včetně genetických a epigenetických modifikací (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Hromadné důkazy (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) naznačují, že peritoneální mikroprostředí žen postižených endometriózou podléhá řadě lokálních zánětlivých-reparativních jevů se zapojením rezidentních makrofágů a přitahováním a získáváním periferních mononukleárních buňky (monocyty a lymfocyty) z krve do peritoneální dutiny: během endometriózy dochází k rozpadu endometriální a peritoneální homeostázy způsobené proliferací buněk adresovaných cytokiny (Pizzo et al, 2002) a dysregulací apoptózy (Sturlese et al, 2011; Salmeri et al, 2015).

Monocyty hrají klíčovou roli během adaptivní imunity, protože migrují v místech infekce nebo zánětu, diferencují se v makrofázích a působí jako buňky prezentující antigen (APC).

Od jejich první identifikace fagocytózy Eliem Metchnikoffem v Messině (JAMA, 1968), po experimentech na larvách hvězdic, nám mnoho kroků vpřed umožnilo získat široký přehled makrofágů kromě jejich role jako fagocytárních buněk.

Okolní mikroprostředí může řešit plasticitu makrofágů směrem k přechodné a reverzibilní polarizaci. Tyto polarizované fenotypy odrážejí prozánětlivý nebo protizánětlivý stav a mohou se v průběhu času měnit. Mohou být funkčně klasifikovány do dvou hlavních populací: „klasicky aktivované“ makrofágy (M1) a „alternativně aktivované“ makrofágy (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Ačkoli se všeobecně uznává, že M1 a M2 představují dva terminály plného spektra aktivace makrofágů (Liu et al, 2014), nedávná data (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) umožnilo charakterizovat tyto dvě populace takto:

• M1 Makrofágy: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 Makrofágy: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Studijní populace: Výzkumníci vyberou pacientky postižené histologicky potvrzenou endometriózou (případy) a ovariálními funkčními cystami (kontroly), které podstoupí laparoskopickou operaci. V souladu s revidovanou klasifikací endometriózy Americké společnosti pro reprodukční medicínu (Rock JA, 1995) budou endometriotické pacientky rozděleny do 4 skupin: minimální, lehká, střední a těžká stadia endometriózy.

Veškerý laparoskopický výkon bude proveden během proliferační fáze menstruačního cyklu. Vyšetřovatelé vyloučí ze studie ženy postižené jinými pánevními poruchami, chronickým oběhovým, autoimunitním nebo neoplastickým onemocněním a které v předchozích 6 měsících užívaly jakékoli protizánětlivé nebo hormonální nebo imunomodulační léky.

Příprava vzorku tkáně a charakterizace makrofágů: Tkáňové řezy (endometriotické tkáně pro případy, ovariální funkční cysty pro kontroly) budou rozemlety a inkubovány v enzymovém koktejlu obsahujícím konečné koncentrace 3,4 mg/ml pankreatinu, 0,1 mg/ml hyaluronidázy a 1,6 mg/ml kolagenáza I v Hankově pufrovaném fyziologickém roztoku (HBSS) obsahujícím 2 mg/ml D-glukózy při 37 °C po dobu 2 hodin. Po štěpení budou buňky dispergovány sítem přes síto 250 μm a promyty HBSS. Tkáňové buňky budou obarveny a fixovány pro analýzu průtokovou cytometrií. Před izolací makrofágů budou mrtvé buňky z kultury odstraněny pomocí soupravy pro odstranění mrtvých buněk. Životaschopnost buněk bude hodnocena vyloučením trypanové modři.

K posouzení povrchové exprese makrofágových markerů se vzorky tkáně obarví pro průtokovou cytometrii monoklonálními protilátkami konjugovanými s fluorochromem proti CD14, CD68, CCR7 a CD80 k identifikaci M1, zatímco monoklonálními protilátkami konjugovanými s fluorochromem proti CD14, CD68, CD163 a CD206 k identifikaci M2.

Statistická analýza: Předpoklad normálního rozdělení pro spojité proměnné bude testován Kolmogorov-Smirnov testem na dobrou shodu. Všechny inferenční analýzy budou provedeny pomocí neparametrických statistických testů. Nenormálně rozdělené proměnné mezi skupinami budou porovnány pomocí Kruskal-Wallisova testu. Rozsah statistické významnosti bude P < 0,05. Kromě toho budou vyšetřovatelé k analýze dat používat post hoc vícenásobné srovnávací testy buď proti kontrolám nebo proti každé fázi.