Оценка макрофагов М1 и М2 в эндометриоидной ткани женщин, пораженных эндометриозом на разных стадиях.

Предпосылки и обоснование. Эндометриоз — это эстрогензависимое заболевание, определяемое эктопическим присутствием и ростом функциональной ткани эндометрия, желез и стромы вне полости матки (Kavoussi et al, 2016). Этиопатогенез эндометриоза до сих пор остается спорным: могут быть задействованы иммунные, гормональные, генетические и эпигенетические факторы, и для его объяснения было предложено несколько теорий.

Заболевание поражает 2–10 % женщин репродуктивного возраста и 50 % женщин с бесплодием (Dunselman et al, 2014) и может вызывать тазовую боль (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), аномальные кровотечения, бесплодие/бесплодие. и, следовательно, важные психологические проблемы (Laganà et al, 2015). Эндометриоз классифицируют в зависимости от количества, размера и поверхностного и/или глубокого расположения эндометриальных имплантатов, бляшек, эндометриом и/или спаек. Наиболее часто используемая классификация эндометриоза была разработана Американским обществом репродуктивной медицины (Rock JA, 1995), хотя для глубокого инфильтративного эндометриоза может использоваться и другая классификация (Haas et al, 2011) или для корреляции эндометриоза и бесплодия (Adamson et al, 2010).

Как широко известно (Donnez et al, 2016), общепризнанно, что умеренное/тяжелое бесплодие, связанное с эндометриозом, связано с механическими факторами, а именно с искажением/подрывом обычной анатомии таза. Напротив, факторы бесплодия/субфертильности, связанные с минимальным/легким эндометриозом, менее ясны. Тем не менее, на сегодняшний день ни один из предполагаемых механизмов не смог исчерпывающе объяснить бесплодие, связанное с эндометриозом, в то время как возможно, что такое заболевание вызывается сразу несколькими факторами, включая генетические и эпигенетические модификации (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Накопленные данные (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) свидетельствуют о том, что перитонеальная микросреда женщин, пораженных эндометриозом, подвергается ряду локальных воспалительно-репаративных явлений с участием резидентных макрофагов, а также привлечением и рекрутированием периферических мононуклеарных клеток. клетки (моноциты и лимфоциты) из крови в брюшную полость: при эндометриозе происходит нарушение эндометриального и перитонеального гомеостаза, вызванное направленной на цитокины пролиферацией клеток (Pizzo et al, 2002) и нарушением регуляции апоптоза (Sturlese et al, 2011; Salmeri и др., 2015).

Моноциты играют ключевую роль во время адаптивного иммунитета, поскольку они мигрируют в очаги инфекции или воспаления, дифференцируются в макрофаги и действуют как антигенпрезентирующие клетки (АПК).

Со времени их первой идентификации фагоцитоза Эли Мечниковым в Мессине (JAMA, 1968), после экспериментов на личинках морских звезд, многие шаги вперед позволили нам получить широкое представление о макрофагах, помимо их роли в качестве фагоцитирующих клеток.

Окружающее микроокружение может влиять на пластичность макрофагов по отношению к временной и обратимой поляризации. Эти поляризованные фенотипы отражают провоспалительный или противовоспалительный статус и могут меняться с течением времени. Их можно функционально разделить на две основные популяции: «классически активированные» макрофаги (M1) и «альтернативно активированные» макрофаги (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Хотя общепризнано, что M1 и M2 представляют собой два окончания полного спектра активации макрофагов (Liu et al, 2014), последние данные (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) позволило охарактеризовать эти две популяции следующим образом:

• M1 Макрофаги: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 Макрофаги: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Исследуемая популяция: Исследователи отберут пациенток с гистологически подтвержденным эндометриозом (случаи) и функциональными кистами яичников (контрольная группа), которым будет проведена лапароскопическая операция. В соответствии с пересмотренной классификацией эндометриоза Американского общества репродуктивной медицины (Rock JA, 1995) пациентки с эндометриозом будут разделены на 4 группы: минимальная, легкая, умеренная и тяжелая стадии эндометриоза.

Все лапароскопические процедуры будут выполняться во время пролиферативной фазы менструального цикла. Исследователи исключат из исследования женщин, страдающих другими заболеваниями органов малого таза, хроническими заболеваниями органов кровообращения, аутоиммунными или неопластическими заболеваниями и принимавших какие-либо противовоспалительные, гормональные или иммуномодулирующие препараты в течение предшествующих 6 месяцев.

Подготовка образцов тканей и характеристика макрофагов: срезы тканей (эндометриоидная ткань для случаев, функциональные кисты яичников для контроля) измельчают и инкубируют в коктейле ферментов, содержащем конечные концентрации панкреатина 3,4 мг/мл, гиалуронидазы 0,1 мг/мл и гиалуронидазы 1,6 мг/мл. коллагеназы I в забуференном солевом растворе Хенкса (HBSS), содержащем 2 мг/мл D-глюкозы, при 37°C в течение 2 часов. После переваривания клетки будут диспергированы путем процеживания через сито с размером ячеек 250 мкм и промыты HBSS. Тканевые клетки будут окрашены и зафиксированы для проточного цитометрического анализа. Перед выделением макрофагов мертвые клетки будут удалены из культуры с помощью набора для удаления мертвых клеток. Жизнеспособность клеток оценивают по исключению трипанового синего.

Для оценки поверхностной экспрессии маркеров макрофагов образцы тканей будут окрашивать для проточной цитометрии моноклональными антителами, конъюгированными с флуорохромом, против CD14, CD68, CCR7 и CD80 для идентификации M1, тогда как моноклональными антителами, конъюгированными с флуорохромом, против CD14, CD68, CD163 и CD206 для идентификации М2.

Статистический анализ: Предположение о нормальном распределении непрерывных переменных будет проверено с помощью теста Колмогорова-Смирнова на соответствие. Все логические анализы будут выполняться с использованием непараметрических статистических тестов. Ненормально распределенные переменные между группами будут сравниваться с использованием теста Крускала-Уоллиса. Диапазон статистической значимости будет P < 0,05. Кроме того, исследователи будут использовать постфактум множественные сравнительные тесты либо с контролем, либо с каждым этапом для анализа данных.