위장암의 차세대 시퀀싱

샘플 DNA 처리: 말초 혈액 림프구(PBL) 및 혈장을 각 환자의 분석을 위해 수집했습니다. EDTA가 첨가된 혈액 샘플을 포함하는 10mL 튜브를 10분 동안 1000g에서 원심분리했습니다. 말초 혈액 림프구를 포함하는 세포 펠릿은 -20°C에서 보관되었습니다. 상등액을 다시 10,000g에서 10분 동안 원심분리하고 혈장을 수집하여 -80°C에 보관했습니다. Tiangen whole blood DNA Kit(Tiangen, Beijing, PRC)를 사용하여 각각 말초 혈액 림프구에서 DNA를 추출했습니다. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen, German)를 사용하여 cfDNA 형태 혈장을 추출했습니다. 모든 키트는 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다.

라이브러리 준비 및 시퀀싱: 각 샘플에 대해 제조업체의 권장 프로토콜로 Qubit dsDNA HS 분석 키트(Life Technologies, USA)를 사용하여 DNA를 정량화했습니다. 제조업체의 지침(Questgenomics, Nanjing, PRC)에 따라 Amplicon Sequencing-Illumina Compatible Kit를 사용하여 표적 증폭 및 Illumina 어댑터 결찰 라이브러리 준비를 수행했습니다. 모든 샘플은 페어드 엔드 시퀀싱(각 엔드 150bp)을 위해 Illumina HiSeq X-Ten에 적용되었습니다. AmpliSeq Cancer Panel은 Co. Roche에서 개발한 1406개의 암 관련 유전자를 다룹니다.

변형 호출： HiSeq X-Ten의 초기 데이터는 fastQC(v0.11.3)를 사용하여 평가되었습니다. 원시 읽기는 BWA(0.7.12-r1039)를 사용하여 참조 게놈 hg19에 매핑되었습니다. 프로그램 Samtools 및 VarScan(v2.4.1)은 변형 호출에 사용되었습니다. (1) 평균 총 커버리지 깊이는 >1000으로 정의되었고 각 변형 커버리지는 >10으로 정의되었습니다. 호출된 변형에 대해 변형 빈도 >1%, 각 샘플의 변형 빈도 >0.5% 및 P 값을 갖는 하나 이상의 샘플

통계 분석： 변이 빈도가 0.5% 미만인 경우 0으로 대체되었습니다. R(hclust, v3.2.4)은 암 환자의 어떤 유형의 샘플이 더 유사한지를 보여주기 위해 변이 빈도 클러스터링 분석에 사용되었습니다. cfDNA 농도와 p의 비교를 위해 스튜던트 T 테스트를 적용했습니다.