Neste generasjons sekvensering i gastrointestinal kreft

Prøve-DNA-håndtering: Perifere blodlymfocytter (PBL) og plasma ble samlet inn for analyse for hver pasient. 10 ml rør som inneholdt blodprøver tilsatt EDTA ble sentrifugert ved 1000 g i 10 minutter. Cellepelletene som inneholdt perifere blodlymfocytter ble lagret ved -20 °C. Supernatantene ble sentrifugert igjen ved 10 000 g i 10 minutter, og plasma ble samlet og lagret ved -80°C. Tiangen fullblod DNA Kit (Tiangen, Beijing, PRC) ble brukt til å ekstrahere DNA fra henholdsvis perifere blodlymfocytter. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, tysk) ble brukt til å ekstrahere cfDNA fra plasma. Alle settene ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner.

Bibliotekforberedelse og sekvensering: For hver prøve ble DNA kvantifisert med Qubit dsDNA HS-analysesettet (Life Technologies, USA) som produsentens anbefalte protokoll. Målrettet amplifikasjon og Illumina-adapterligert bibliotekspreparat ble utført ved bruk av Amplicon Sequencing-Illumina Compatible Kit etter produsentens instruksjoner (Questgenomics, Nanjing, PRC). Alle prøver ble utsatt for Illumina HiSeq X-Ten for sekvensering av paret ende (150 bp hver ende). AmpliSeq Cancer Panel dekker 1406 kreftassosierte gener utviklet av Co. Roche.

Variantkall: Innledende data fra HiSeq X-Ten ble evaluert ved å bruke fastQC (v0.11.3). Råavlesninger ble kartlagt til referansegenom hg19 ved å bruke BWA (0.7.12-r1039). Program Samtools og VarScan (v2.4.1) ble brukt for variantanrop: (1) gjennomsnittlig total dekningsdybde ble definert som >1000 og hver variantdekning som >10; for kalt variant, minst én prøve med variantfrekvens >1 %, variantfrekvens for hver prøve >0,5 % og P-verdi

Statistisk analyse: For variantfrekvens mindre enn 0,5 % ble 0 erstattet. R (hclust, v3.2.4) ble brukt til variantfrekvensklyngeanalyse for å vise hvilke typer prøver fra kreftpasienter som er mer like. Students T-test ble brukt for sammenligning av cfDNA-konsentrasjon og p