胃肠道癌的新一代测序

样本 DNA 处理： 收集每个患者的外周血淋巴细胞 (PBL) 和血浆用于分析。 将含有添加了 EDTA 的血样的 10mL 试管以 1000g 离心 10 分钟。 含有外周血淋巴细胞的细胞沉淀储存在-20°C。 将上清液再次以 10,000 g 离心 10 分钟，收集血浆并在-80°C 下储存。使用天根全血 DNA 试剂盒（Tiangen，北京，中国）分别从外周血淋巴细胞中提取 DNA。 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen，德国）用于从血浆中提取 cfDNA。 所有试剂盒均按照制造商的说明使用。

文库制备和测序： 对于每个样本，按照制造商推荐的方案，使用 Qubit dsDNA HS Assay kit (Life Technologies, USA) 对 DNA 进行定量。 按照制造商的说明（Questgenomics，中国南京），使用 Amplicon Sequencing-Illumina Compatible Kit 进行靶向扩增和 Illumina 适配器连接的文库制备。 所有样品都经过 Illumina HiSeq X-Ten 进行双端测序（每端 150bp）。 AmpliSeq Cancer Panel 涵盖了罗氏公司开发的 1406 个癌症相关基因。

Variant calling： HiSeq X-Ten 的初始数据使用 fastQC (v0.11.3) 进行评估。 使用 BWA (0.7.12-r1039) 将原始读数映射到参考基因组 hg19。 程序 Samtools 和 VarScan (v2.4.1) 用于变体调用：(1) 平均总覆盖深度定义为 >1000，每个变体覆盖度 >10；对于called variant，至少有一个样本的变异频率>1%，每个样本的变异频率>0.5%，P值

统计分析：变异频率小于0.5%时，用0代替。 R（hclust，v3.2.4）用于变异频率聚类分析，以显示癌症患者的哪些类型的样本更相似。 应用学生 T 检验比较 cfDNA 浓度和 p