消化器がんにおける次世代シーケンシング

サンプル DNA の取り扱い： 各患者の分析のために、末梢血リンパ球 (PBL) と血漿を採取しました。 EDTA を添加した血液サンプルを含む 10 mL チューブを 1000 g で 10 分間遠心分離しました。 末梢血リンパ球を含む細胞ペレットは、-20 ° C で保存されました。 上清を再度 10,000 g で 10 分間遠心分離し、血漿を収集して -80°C で保存しました。 Tiangen 全血 DNA キット (Tiangen、北京、中国) を使用して、末梢血リンパ球からそれぞれ DNA を抽出しました。 血漿からｃｆＤＮＡを抽出するために、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎ）を使用した。 すべてのキットは、製造元の指示に従って使用されました。

ライブラリーの調製とシーケンシング： 各サンプルについて、製造元の推奨プロトコルとして、Qubit dsDNA HS Assay kit (Life Technologies, USA) を使用して DNA を定量しました。 Amplicon Sequencing-Illumina Compatible Kit を使用して、製造元 (Questgenomics、中国、南京) の指示に従って、標的増幅および Illumina アダプター ライゲーション ライブラリーの調製を行いました。 すべてのサンプルをイルミナ HiSeq X-Ten にかけ、ペアエンド シーケンスを行いました (両端 150bp)。 AmpliSeq がんパネルは、Roche 社が開発した 1406 のがん関連遺伝子をカバーしています。

バリアント コール： HiSeq X-Ten の初期データは、fastQC (v0.11.3) を使用して評価されました。 生の読み取りは、BWA (0.7.12-r1039) を使用して参照ゲノム hg19 にマッピングされました。 プログラム Samtools および VarScan (v2.4.1) はバリアント コールに使用されました。呼び出されたバリアントの場合、バリアント頻度が 1% を超えるサンプルが少なくとも 1 つ、各サンプルのバリアント頻度が 0.5% を超え、P 値が

統計解析：バリアント頻度が0.5%未満の場合は0に置き換えた。 R (hclust、v3.2.4) をバリアント頻度クラスタリング分析に使用して、がん患者からのどのタイプのサンプルがより類似しているかを示しました。 スチューデントの T 検定は、cfDNA 濃度と p の比較に適用されました。