Secuenciación de próxima generación en cáncer gastrointestinal

Manipulación de muestras de ADN： Se recogieron linfocitos de sangre periférica (PBL) y plasma para el análisis de cada paciente. Los tubos de 10 ml que contenían muestras de sangre con EDTA añadido se centrifugaron a 1000 g durante 10 min. Los sedimentos celulares que contenían linfocitos de sangre periférica se almacenaron a -20 °C. Los sobrenadantes se centrifugaron de nuevo a 10.000 g durante 10 min y el plasma se recogió y almacenó a -80°C. Se utilizó el kit de ADN de sangre completa Tiangen (Tiangen, Beijing, República Popular China) para extraer ADN de linfocitos de sangre periférica, respectivamente. Se usó el kit de ácido nucleico circulante QIAamp (Qiagen, alemán) para extraer plasma de forma de cfDNA. Todos los kits se utilizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Preparación y secuenciación de la biblioteca: para cada muestra, se cuantificó el ADN con el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Life Technologies, EE. UU.) según el protocolo recomendado por el fabricante. La amplificación dirigida y la preparación de la biblioteca ligada al adaptador de Illumina se realizaron utilizando el kit compatible con Amplicon Sequencing-Illumina siguiendo las instrucciones del fabricante (Questgenomics, Nanjing, PRC). Todas las muestras se sometieron a Illumina HiSeq X-Ten para la secuenciación de extremos pareados (150 pb en cada extremo). El panel de cáncer AmpliSeq cubre 1406 genes asociados con el cáncer desarrollados por Co. Roche.

Llamada de variante: los datos iniciales de HiSeq X-Ten se evaluaron mediante fastQC (v0.11.3). Las lecturas sin procesar se asignaron al genoma de referencia hg19 mediante el uso de BWA (0.7.12-r1039). Se utilizó el programa Samtools y VarScan (v2.4.1) para las llamadas de variantes: (1) la profundidad de cobertura total promedio se definió como >1000 y la cobertura de cada variante como >10; para la variante llamada, al menos una muestra con frecuencia de variante >1 %, frecuencia de variante de cada muestra >0,5 % y valor P

Análisis estadístico: para la frecuencia de variantes inferior al 0,5%, se reemplazó 0. R (hclust, v3.2.4) se utilizó para el análisis de agrupamiento de frecuencia de variantes para mostrar qué tipos de muestras de pacientes con cáncer son más similares. Se aplicó la prueba T de Student para comparar la concentración de cfDNA y la p