Nästa generations sekvensering i gastrointestinal cancer

Prov-DNA-hantering: Lymfocyter från perifert blod (PBL) och plasma samlades in för analys för varje patient. 10 ml rör innehållande blodprover med EDTA tillsatt centrifugerades vid 1000 g under 10 minuter. Cellpellets innehållande perifera blodlymfocyter lagrades vid -20 °C. Supernatanterna centrifugerades igen vid 10 000 g under 10 minuter, och plasma samlades upp och lagrades vid -80°C. Tiangen helblods-DNA-kit (Tiangen, Beijing, Kina) användes för att extrahera DNA från perifera blodlymfocyter. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, tyska) användes för att extrahera cfDNA från plasma. Alla kit användes enligt tillverkarens instruktioner.

Biblioteksberedning och sekvensering: För varje prov kvantifierades DNA med Qubit dsDNA HS Assay-kit (Life Technologies, USA) som tillverkarens rekommenderade protokoll. Riktad amplifiering och Illumina-adapterligerat biblioteksförberedelse utfördes med användning av Amplicon Sequencing-Illumina Compatible Kit enligt tillverkarens instruktioner (Questgenomics, Nanjing, PRC). Alla prover utsattes för Illumina HiSeq X-Ten för sekvensering av parad ände (150 bp i varje ände). AmpliSeq Cancer Panel täcker 1406 cancerassocierade gener som utvecklats av Co. Roche.

Variantanrop: Initial data från HiSeq X-Ten utvärderades med hjälp av fastQC (v0.11.3). Råavläsningar kartlades till referensgenom hg19 genom att använda BWA (0.7.12-r1039). Program Samtools och VarScan (v2.4.1) användes för variantanrop: (1) det genomsnittliga totala täckningsdjupet definierades som >1000 och varje varianttäckning som >10; för anropad variant, minst ett sampel med variantfrekvens >1 %, variantfrekvens för varje sampel >0,5 % och P-värde

Statistisk analys: För variantfrekvens mindre än 0,5 % ersattes 0. R (hclust, v3.2.4) användes för variantfrekvensklustringsanalys för att visa vilka typer av prover från cancerpatienter som är mer lika. Students T-test användes för jämförelse av cfDNA-koncentration och p