ADHD의 후성유전학

1년 차: ADHD 환자 100명과 건강한 대조군 100명(Training Set)을 모집하여 ADHD에 대한 miRNA 진단 패널 개발

1. 대만 Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital 아동 정신과 외래에서 치료를 받고 있는 적격 ADHD 환자 100명을 이 연구에 모집합니다. 100명의 연령 및 성별 대조 대상이 환자와 동일한 집수 지역에서 발견될 것입니다. 부모나 보호자로부터 정보에 입각한 동의를 얻은 후 연구 정신과 의사는 진단을 확인하기 위해 K-SADS-E를 사용하여 참가자를 인터뷰해야 합니다. 참가자는 또한 지적 장애를 배제하기 위해 WISC-IV 평가를 받게 됩니다.

2. ADHD 환자와 건강한 통제 대상자 모두 경험이 풍부한 아동 심리학자가 일관성 없는 검사 조건을 줄이기 위해 설계된 방에서 Conners CPT 및 Conners CATA 검사를 시행합니다. 부모 또는 보호자는 SNAP-IV 부모 양식 및 SAICA를 작성해야 합니다. 환자의 교사는 SNAP-IV 교사 양식을 작성해야 합니다. ADHD-RS와 CGI는 아동 정신과 의사가 각각 작성하고 평가합니다.

3. 각 참여자로부터 EDTA 항응고제 튜브에 정맥혈을 채취합니다. 혈액 샘플은 전체 RNA를 추출하기 위해 mirVana miRNA 분리 키트(Life 기술)로 추가 처리됩니다. 예비 조사 결과를 기반으로 100개의 ADHD 샘플과 100개의 대조군 샘플에 대해 22개의 후보 miRNA의 ΔCt 값이 결정됩니다. 그런 다음 p-값이 가장 작은 10개의 miRNA를 선택하여 2년차에 ADHD에 대한 miRNA 진단 패널을 개발할 것입니다.

4. ADHD 환자와 건강한 대조군은 12개월간 추적관찰한다. 그 기간 동안 ADHD 환자의 치료 절차는 환자의 정신과 의사의 전통적인 관행과 환자와 부모의 동의에 따라 결정됩니다.

1. 치료를 받기로 결정한 ADHD 환자는 경구 속효성 MPH(MPH-IR)를 1일 2~3회 처방받게 되며 각 용량은 0.3~1.0mg/kg 범위이며 임상 증상의 중증도에 따라 결정됩니다. 나이, 키, 몸무게와 같은 증상이 나타납니다.
2. ADHD 증상을 적절하게 개선하기 위해 2주마다 복용량을 조정합니다. 지속형 MPH(Ritalin-LA) 또는 서방형 메틸페니데이트(Concerta)의 변경은 임상적 요구 사항에 따라 허용됩니다. MPH-IR 및 Ritalin-LA의 일일 최대 용량은 60mg이고 Concerta는 54mg으로 대만에서 승인된 최대 일일 용량입니다. 임상적으로 견딜 수 없는 불리한 조건이 발생하면 복용량을 줄일 수 있습니다. 허용 가능한 반응을 보이는 MPH의 최종 적정 용량은 후속 조치 기간 동안 유지됩니다.
3. 병용 약물은 금지됩니다. 약물 요법의 준수 여부는 환자 부모의 보고와 처방이 얼마나 남아 있는지에 따라 방문할 때마다 확인됩니다. 연구의 다른 시점 사이에 새로운 약물을 시작하는 환자는 중도 탈락으로 간주됩니다.
4. 치료를 받지 않기로 결정한 ADHD 환자는 보통 한 달에 한 번 외래 소아 정신과 의사의 재평가를 받고 연구 기간 동안 행동 치료 또는 재교육적 심리 치료를 받을 수 있습니다.
5. 건강한 통제 대상자는 기준선에서 한 번만 평가됩니다. 5. ADHD 환자는 기준선 후 12개월째에 재평가됩니다. 기준선에서 관리된 miRNA 분석 및 ADHD 측정을 포함한 평가 절차가 복제됩니다.

2년차: SVM 분류 모델 개발 및 ADHD 환자 50명과 건강한 대조군 50명으로 구성된 독립 검증 그룹 등록(테스트 세트)

1. 이미 수집된 샘플을 기반으로 ADHD 그룹과 대조군 사이에서 가장 차등적으로 발현되는 10개의 miRNA를 결정할 수 있습니다. 이 10개의 값을 사용하여 SVM 분류 모델을 도출하고 ADHD에 대한 신뢰할 수 있고 강력한 miRNA 진단 패널을 만들 수 있습니다. 이 miRNA 진단 패널의 유효성을 평가하기 위해 수신자 작동 특성(ROC) 곡선이 적용됩니다. 이 패널의 특이성과 민감도는 모두 80%에 이를 것으로 예상됩니다.
2. 독립 검증 그룹(Testing Set)의 경우 ADHD 적격 환자 50명과 연령 및 성별이 일치하는 건강한 대조군 50명이 모집됩니다. 연구 정신과 의사는 진단을 확인하기 위해 K-SADS-E를 사용하여 참가자를 인터뷰하고 참가자는 지적 장애를 배제하기 위해 WISC-IV 평가도 받습니다.
3. 모든 ADHD 환자와 건강한 대조군은 경험이 풍부한 아동 심리학자가 Conners의 CPT 및 Conners의 CATA 테스트를 관리하게 됩니다. 참가자의 부모 또는 보호자는 SNAP-IV 부모 양식 및 SAICA를 작성해야 합니다. 환자의 교사는 SNAP-IV 교사 양식을 작성해야 합니다. ADHD-RS와 CGI는 아동 정신과 의사가 각각 작성하고 평가합니다.
4. EDTA 항응고제 튜브를 사용하여 각 참가자로부터 정맥혈을 채취합니다. 혈액 샘플은 전체 RNA를 추출하기 위해 mirVana miRNA 분리 키트(Life 기술)로 추가 처리됩니다. SVM 분류 모델을 위해 선택된 10개의 miRNA의 수준은 qRT-PCR에 의해 결정됩니다.
5. Training Set의 결과를 검증하기 위해 Testing Set의 miRNA 데이터(ADHD 환자 50명과 건강한 대조군 50명 모두)를 miRNA 진단 패널의 블라인드 테스트에 사용합니다. 변별 타당도는 민감도와 특이도가 모두 80%에 도달할 것으로 예상합니다.
6. ADHD 환자의 치료 및 추적관찰은 1차년도와 동일합니다. 첫 해에 모집된 100명의 ADHD 환자를 추적하고 재평가할 예정입니다.

3년 차: ADHD 환자에 대한 12개월 추적 관찰 완료 및 miRNA의 표적 유전자 및 농축 경로 분석 수행

1. 3년 차에는 신규 참가자를 모집하지 않습니다. ADHD 환자 150명 모두에 대한 12개월 추적 조사가 올해 안에 완료될 예정이다.
2. ADHD 환자에 대한 2차 평가를 수행하여 이 연구를 결론지을 것입니다(기준선 후 12개월째). 기준선에서 관리되었던 동일한 평가 절차가 복제됩니다.

(1) miRNA를 추출하기 위해 혈액 샘플을 수집하고 다시 처리합니다. (2) 연구 정신과 의사는 환자가 여전히 ADHD의 진단 기준을 충족하는지 확인하기 위해 K-SADS-E를 사용하여 ADHD 환자를 인터뷰합니다.

(3) ADHD 환자는 신경심리학적 검사(WISC-IV, Conners CPT 및 Conners CATA)를 받고 기준선에서 동일한 평가자에 의해 행동 증상이 평가됩니다(SNAP-IV, SAICA, ADHD-RS 및 CGI). 약물로 인한 편견을 피하기 위해 ADHD 환자는 신경심리학적 평가 당일에 약물을 복용하지 말라고 지시받을 것입니다.

3. 12개월 추적 기간 동안 miRNA 수준의 추세를 확인합니다. MPH 치료를 받은 환자와 받지 않은 환자 사이, 그리고 ADHD 진단을 완화한 환자와 지속하는 환자 사이의 miRNA 수준 차이를 평가할 것입니다. miRNA가 치료 후 ADHD 상태를 나타내는 바이오마커로 기능할 수 있는지 여부가 결정될 것입니다.

4. TargetScan v6.2, miRWalk 및 DIANA-microT를 사용하여 차등적으로 발현된 miRNA의 예상 표적 유전자 및 농축 경로를 얻습니다. 검색은 p-값이 0.05인 대상 miRNA의 3'-UTR 영역에만 집중하여 최소 miRNA 시드 길이가 7인 소프트웨어에 설정된 무작위 일치의 확률 분포를 정의합니다.