DNA-KVANTIFIKASJONSTEKNIKK SOM ET FORTOLKNINGSVERKTØY VED MITOKONDRIELLE SYKDOMMER

2622/5000 Mitokondrielle sykdommer (MM) er de vanligste stoffskiftesykdommene. Siden disse patologiene er svært heterogene i kliniske termer, bekrefter bare identifiseringen av mutasjoner i kjernefysiske gener eller mitokondrielt DNA diagnosen.

Fullskalastudiet av mtDNA ved hjelp av high-throughput sekvensering (NGS) er et første trinn i den diagnostiske tilnærmingen. Den nylige introduksjonen av denne revolusjonerende nye teknologien har i stor grad økt effektiviteten av mutasjonsidentifikasjon. Imidlertid, i tillegg til kjente patogene mutasjoner, avslører NGS en rekke varianter hvis betydning foreløpig er ukjent. En stor utfordring for å få en pålitelig diagnose er derfor tolkningen av den kliniske effekten av disse nye sjeldne variantene som viser seg å være svært vanskelig.

Patogenitetskriterier tillater klassifisering av varianter fra benigne til patogene. Et av de viktigste patogenisitetskriteriene er en god korrelasjon av heteroplasmatisk nivå med vev eller cellulær involvering. Faktisk er mtDNA-mutasjoner generelt heteroplasmatiske, som tilsvarer sameksistensen av normale og muterte molekyler i samme celle eller vev, de mest berørte vevene har en høy mutasjonshastighet. På en muskelbiopsi av en affisert pasient viser fibrene ofte en enzymmangel i cytokrom c-oksidase (COX-negativ) som kan påvises i immunhistokjemi. Enkeltfiberstudien gjør det mulig å isolere de mangelfulle fibrene og kvantifisere den heteroplasmatiske hastigheten til en variant. Tilstedeværelsen av et høyt nivå av heteroplasma i de COX-negative fibrene, i motsetning til fibre uten underskudd, er et sterkt argument for patogenisiteten til denne varianten. Foreløpig brukes ikke denne teknikken rutinemessig i diagnostiske laboratorier, men bare av og til i et forskningsrammeverk i noen laboratorier. Det er en tung teknikk som består av et første trinn med lasermikrodisseksjon av de ulike muskelfibrene etterfulgt av et andre trinn med kvantifisering av varianten fra hver fiber. Dette andre trinnet krever et spesifikt fokus for hver identifiserte variant.

Målet med denne pilotstudien er å utvikle en ny teknikk for kvantifisering av single-fiber heteroplasmics isolert ved NGS laser mikrodisseksjon. Dette, uavhengig av type variant, vil unngå de lange og kostbare justeringene som kreves for hver ny identifisert variant og dermed lette bruken av den.