TECHNIKA ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA DNA JAKO NARZĘDZIE INTERPRETACYJNE W CHOROBACH MITOCHONDRIALNYCH

2622/5000 Choroby mitochondrialne (MM) są najczęstszymi chorobami metabolicznymi. Ponieważ te patologie są bardzo heterogenne pod względem klinicznym, dopiero identyfikacja mutacji w genach jądrowych lub mitochondrialnym DNA potwierdza rozpoznanie.

Pełnowymiarowe badanie mtDNA za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania (NGS) jest pierwszym krokiem w podejściu diagnostycznym. Niedawne wprowadzenie tej rewolucyjnej nowej technologii znacznie zwiększyło skuteczność identyfikacji mutacji. Jednak oprócz znanych mutacji patogennych NGS ujawnia liczne warianty, których znaczenie jest obecnie nieznane. Głównym wyzwaniem dla uzyskania wiarygodnej diagnozy jest zatem interpretacja wpływu klinicznego tych nowych rzadkich wariantów, co okazuje się bardzo trudne.

Kryteria chorobotwórczości pozwalają na klasyfikację wariantów od łagodnych do patogennych. Jednym z głównych kryteriów patogeniczności jest dobra korelacja poziomu heteroplazmy z zajęciem tkanki lub komórki. Rzeczywiście, mutacje mtDNA są na ogół heteroplazmatyczne, co odpowiada współistnieniu normalnych i zmutowanych cząsteczek w tej samej komórce lub tkance, przy czym najbardziej dotknięte tkanki mają wysoki wskaźnik mutacji. W biopsji mięśni chorego pacjenta włókna często wykazują niedobór enzymu oksydazy cytochromu c (ujemny pod względem COX), co można wykazać w badaniach immunohistochemicznych. Badanie pojedynczego włókna pozwala wyizolować włókna z niedoborem i określić ilościowo stopień heteroplazmy wariantu. Obecność wysokiego poziomu heteroplazmy we włóknach COX-ujemnych, w przeciwieństwie do włókien bez deficytu, jest silnym argumentem przemawiającym za patogenicznością tego wariantu. Obecnie technika ta nie jest stosowana rutynowo w laboratoriach diagnostycznych, a jedynie okazjonalnie w ramach badań w niektórych laboratoriach. Jest to ciężka technika, która składa się z pierwszego etapu mikrodysekcji laserowej różnych włókien mięśniowych, po którym następuje drugi etap kwantyfikacji wariantu z każdego włókna. Ten drugi krok wymaga szczególnego skupienia się na każdym zidentyfikowanym wariancie.

Celem tego badania pilotażowego jest opracowanie nowej techniki kwantyfikacji heteroplazmatycznych pojedynczych włókien izolowanych za pomocą mikrodysekcji laserowej NGS. To, niezależnie od rodzaju wariantu, pozwoli uniknąć długich i kosztownych dostosowań wymaganych dla każdego nowego zidentyfikowanego wariantu, a tym samym ułatwi jego stosowanie