DNA-KWANTIFICATIETECHNIEK ALS INTERPRETATIE-INSTRUMENT BIJ MITOCHONDRIALE ZIEKTEN

2622/5000 Mitochondriale ziekten (MM) zijn de meest voorkomende stofwisselingsziekten. Aangezien deze pathologieën klinisch zeer heterogeen zijn, bevestigt alleen de identificatie van mutaties in nucleaire genen of mitochondriaal DNA de diagnose.

De volledige studie van mtDNA door high-throughput sequencing (NGS) is een eerste stap in de diagnostische aanpak. De recente introductie van deze revolutionaire nieuwe technologie heeft de efficiëntie van mutatie-identificatie enorm vergroot. Naast bekende pathogene mutaties onthult NGS echter talrijke varianten waarvan de betekenis momenteel onbekend is. Een grote uitdaging om tot een betrouwbare diagnose te komen, is dan ook de interpretatie van de klinische impact van deze nieuwe zeldzame varianten, die erg moeilijk blijkt te zijn.

Pathogeniciteitscriteria maken de classificatie van varianten van goedaardig tot pathogeen mogelijk. Een van de belangrijkste pathogeniteitscriteria is een goede correlatie van heteroplasmatisch niveau met weefsel- of cellulaire betrokkenheid. MtDNA-mutaties zijn inderdaad over het algemeen heteroplasmatisch, wat overeenkomt met het naast elkaar bestaan ​​van normale en gemuteerde moleculen in dezelfde cel of hetzelfde weefsel, waarbij de meest aangetaste weefsels een hoge mate van mutatie hebben. Bij een spierbiopsie van een getroffen patiënt vertonen de vezels vaak een enzymdeficiëntie in cytochroom c-oxidase (COX-negatief), wat kan worden aangetoond in immunohistochemie. De studie met één vezel maakt het mogelijk om de gebrekkige vezels te isoleren en de heteroplasmatische snelheid van een variant te kwantificeren. De aanwezigheid van een hoog niveau van heteroplasma in de COX-negatieve vezels, in tegenstelling tot vezels zonder tekort, is een sterk argument voor de pathogeniteit van deze variant. Momenteel wordt deze techniek niet routinematig gebruikt in diagnostische laboratoria, maar slechts af en toe in een onderzoekskader in sommige laboratoria. Het is een zware techniek die bestaat uit een eerste fase van lasermicrodissectie van de verschillende spiervezels, gevolgd door een tweede stap van kwantificering van de variant van elke vezel. Deze tweede stap vereist een specifieke focus voor elke geïdentificeerde variant.

Het doel van deze pilootstudie is het ontwikkelen van een nieuwe techniek voor het kwantificeren van single-fiber heteroplasmics geïsoleerd door NGS laser microdissectie. Dit, onafhankelijk van het type variant, voorkomt de lange en kostbare aanpassingen die nodig zijn voor elke nieuwe geïdentificeerde variant en vergemakkelijkt zo het gebruik ervan