TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DE DNA COMO FERRAMENTA DE INTERPRETAÇÃO EM DOENÇAS MITOCONDRIAIS

2622/5000 As doenças mitocondriais (MM) são as doenças metabólicas mais comuns. Sendo estas patologias muito heterogéneas em termos clínicos, apenas a identificação de mutações em genes nucleares ou no ADN mitocondrial confirma o diagnóstico.

O estudo em grande escala do mtDNA por sequenciamento de alto rendimento (NGS) é um primeiro passo na abordagem diagnóstica. A recente introdução desta nova tecnologia revolucionária aumentou muito a eficiência da identificação de mutações. No entanto, além das mutações patogênicas conhecidas, o NGS revela inúmeras variantes cujo significado é atualmente desconhecido. Um grande desafio para obter um diagnóstico confiável é, portanto, a interpretação do impacto clínico dessas novas variantes raras, que se mostra muito difícil.

Os critérios de patogenicidade permitem classificar as variantes de benignas a patogênicas. Um dos principais critérios de patogenicidade é uma boa correlação do nível heteroplasmático com tecido ou envolvimento celular. Com efeito, as mutações do mtDNA são geralmente heteroplásmicas, o que corresponde à coexistência de moléculas normais e mutantes na mesma célula ou tecido, apresentando os tecidos mais afetados uma elevada taxa de mutação. Em uma biópsia muscular de um paciente afetado, as fibras frequentemente apresentam uma deficiência enzimática na citocromo c oxidase (COX-negativa) que pode ser demonstrada na imuno-histoquímica. O estudo de fibra única permite isolar as fibras deficientes e quantificar a taxa heteroplásmica de uma variante. A presença de alto teor de heteroplasma nas fibras COX-negativas, ao contrário das fibras sem déficit, é um forte argumento a favor da patogenicidade desta variante. Atualmente, esta técnica não é utilizada rotineiramente em laboratórios de diagnóstico, mas apenas ocasionalmente em um quadro de pesquisa em alguns laboratórios. É uma técnica pesada que consiste em uma primeira etapa de microdissecção a laser das diversas fibras musculares seguida de uma segunda etapa de quantificação da variante de cada fibra. Esta segunda etapa requer um foco específico para cada variante identificada.

O objetivo deste estudo piloto é desenvolver uma nova técnica para quantificação de fibras heteroplásmicas isoladas por microdissecção a laser NGS. Isso, independente do tipo de variante, evitará os longos e custosos ajustes necessários para cada nova variante identificada e, assim, facilitará seu uso