DNA-KVANTIFIKATIONSTEKNIK SOM ET FORTOLKNINGSVÆRKTØJ I MITOCHONDRIELLE SYGDOMME

2622/5000 Mitokondrielle sygdomme (MM) er de mest almindelige stofskiftesygdomme. Da disse patologier er meget heterogene i klinisk henseende, bekræfter kun identifikation af mutationer i nukleare gener eller mitokondrielt DNA diagnosen.

Fuldskalastudiet af mtDNA ved high-throughput sekventering (NGS) er et første skridt i den diagnostiske tilgang. Den nylige introduktion af denne revolutionerende nye teknologi har i høj grad øget effektiviteten af ​​mutationsidentifikation. Ud over kendte patogene mutationer afslører NGS imidlertid adskillige varianter, hvis betydning i øjeblikket er ukendt. En stor udfordring for at opnå en pålidelig diagnose er derfor fortolkningen af ​​den kliniske effekt af disse nye sjældne varianter, som viser sig at være meget vanskelig.

Patogenicitetskriterier tillader klassificering af varianter fra benigne til patogene. Et af de vigtigste patogenicitetskriterier er en god korrelation af heteroplasmatisk niveau med vævs- eller cellulær involvering. Faktisk er mtDNA-mutationer generelt heteroplasmatiske, hvilket svarer til sameksistensen af ​​normale og muterede molekyler i samme celle eller væv, hvor de mest berørte væv har en høj mutationshastighed. På en muskelbiopsi af en påvirket patient viser fibrene ofte en enzymmangel i cytochrom c-oxidase (COX-negativ), hvilket kan påvises i immunhistokemi. Enkeltfiberundersøgelsen gør det muligt at isolere de mangelfulde fibre og kvantificere den heteroplasmatiske hastighed af en variant. Tilstedeværelsen af ​​et højt niveau af heteroplasma i de COX-negative fibre, i modsætning til fibre uden underskud, er et stærkt argument til fordel for patogeniciteten af ​​denne variant. I øjeblikket bruges denne teknik ikke rutinemæssigt i diagnostiske laboratorier, men kun lejlighedsvis i en forskningsramme i nogle laboratorier. Det er en tung teknik, der består af et første trin af lasermikrodissektion af de forskellige muskelfibre efterfulgt af et andet trin med kvantificering af varianten fra hver fiber. Dette andet trin kræver et specifikt fokus for hver identificeret variant.

Formålet med denne pilotundersøgelse er at udvikle en ny teknik til kvantificering af enkeltfiber heteroplasma isoleret ved NGS laser mikrodissektion. Dette vil, uafhængigt af typen af ​​variant, undgå de lange og dyre justeringer, der kræves for hver ny identificeret variant og dermed lette brugen af ​​den.