DNA-QUANTIFIZIERUNGSTECHNIK ALS INTERPRETATIONSWERKZEUG BEI MITOCHONDRIALEN ERKRANKUNGEN

2622/5000 Mitochondriale Erkrankungen (MM) sind die häufigsten Stoffwechselerkrankungen. Da diese Pathologien klinisch sehr heterogen sind, bestätigt nur der Nachweis von Mutationen in Kerngenen oder mitochondrialer DNA die Diagnose.

Die umfassende Untersuchung von mtDNA mittels Hochdurchsatzsequenzierung (NGS) ist ein erster Schritt im diagnostischen Ansatz. Die kürzliche Einführung dieser revolutionären neuen Technologie hat die Effizienz der Mutationsidentifizierung erheblich gesteigert. Zusätzlich zu den bekannten pathogenen Mutationen deckt NGS jedoch zahlreiche Varianten auf, deren Bedeutung derzeit unbekannt ist. Eine große Herausforderung für eine zuverlässige Diagnose ist daher die Interpretation der klinischen Auswirkungen dieser neuen seltenen Varianten, die sich als sehr schwierig erweist.

Pathogenitätskriterien ermöglichen die Klassifizierung von Varianten von gutartig bis pathogen. Eines der wichtigsten Pathogenitätskriterien ist eine gute Korrelation des Heteroplasmaspiegels mit der Gewebe- oder Zellbeteiligung. Tatsächlich sind mtDNA-Mutationen im Allgemeinen heteroplasmatisch, was der Koexistenz normaler und mutierter Moleküle in derselben Zelle oder demselben Gewebe entspricht, wobei die am stärksten betroffenen Gewebe eine hohe Mutationsrate aufweisen. Bei einer Muskelbiopsie eines betroffenen Patienten weisen die Fasern häufig einen Enzymmangel der Cytochrom-C-Oxidase (COX-negativ) auf, der immunhistochemisch nachgewiesen werden kann. Die Einzelfaserstudie ermöglicht die Isolierung der defizitären Fasern und die Quantifizierung der Heteroplasmarate einer Variante. Das Vorhandensein eines hohen Anteils an Heteroplasma in den COX-negativen Fasern im Gegensatz zu Fasern ohne Defizit ist ein starkes Argument für die Pathogenität dieser Variante. Derzeit wird diese Technik in diagnostischen Labors nicht routinemäßig eingesetzt, sondern in einigen Labors nur gelegentlich im Forschungsrahmen. Es handelt sich um eine aufwändige Technik, die aus einem ersten Schritt der Laser-Mikrodissektion der verschiedenen Muskelfasern und einem zweiten Schritt der Quantifizierung der Variante jeder Faser besteht. Dieser zweite Schritt erfordert einen spezifischen Fokus für jede identifizierte Variante.

Ziel dieser Pilotstudie ist die Entwicklung einer neuen Technik zur Quantifizierung von Einzelfaser-Heteroplasmen, die durch NGS-Lasermikrodissektion isoliert wurden. Dies erspart unabhängig von der Art der Variante die langwierigen und kostspieligen Anpassungen, die für jede neu identifizierte Variante erforderlich sind, und erleichtert so deren Verwendung