DNA-KVANTIFIKATIONSTEKNIK SOM TOLKNINGSVERKTYG I MITOKONDRIELLA SJUKDOMAR

2622/5000 Mitokondriella sjukdomar (MM) är de vanligaste ämnesomsättningssjukdomarna. Eftersom dessa patologier är mycket heterogena i kliniska termer, bekräftar endast identifieringen av mutationer i nukleära gener eller mitokondriellt DNA diagnosen.

Fullskalig studie av mtDNA genom high-throughput sekvensering (NGS) är ett första steg i det diagnostiska tillvägagångssättet. Den senaste introduktionen av denna revolutionerande nya teknologi har avsevärt ökat effektiviteten av mutationsidentifiering. Men förutom kända patogena mutationer avslöjar NGS många varianter vars betydelse för närvarande är okänd. En stor utmaning för att få en tillförlitlig diagnos är därför tolkningen av den kliniska effekten av dessa nya sällsynta varianter som visar sig vara mycket svår.

Patogenicitetskriterier tillåter klassificering av varianter från benigna till patogena. Ett av de viktigaste patogenicitetskriterierna är en bra korrelation av heteroplasmatisk nivå med vävnads- eller cellulär involvering. Faktum är att mtDNA-mutationer i allmänhet är heteroplasmatiska, vilket motsvarar samexistensen av normala och muterade molekyler i samma cell eller vävnad, de mest påverkade vävnaderna har en hög mutationshastighet. Vid en muskelbiopsi av en drabbad patient uppvisar fibrerna ofta en enzymbrist i cytokrom c-oxidas (COX-negativ) som kan påvisas i immunhistokemi. Enkelfiberstudien gör det möjligt att isolera de bristfälliga fibrerna och att kvantifiera den heteroplasmatiska hastigheten för en variant. Närvaron av en hög nivå av heteroplasma i de COX-negativa fibrerna, till skillnad från fibrer utan underskott, är ett starkt argument till förmån för denna variants patogenicitet. För närvarande används denna teknik inte rutinmässigt i diagnostiska laboratorier utan endast ibland i en forskningsram i vissa laboratorier. Det är en tung teknik som består av ett första steg av lasermikrodissektion av de olika muskelfibrerna följt av ett andra steg av kvantifiering av varianten från varje fiber. Detta andra steg kräver ett specifikt fokus för varje identifierad variant.

Syftet med denna pilotstudie är att utveckla en ny teknik för kvantifiering av enkelfiber heteroplasma isolerad med NGS lasermikrodissektion. Detta, oberoende av typ av variant, kommer att undvika de långa och kostsamma justeringar som krävs för varje ny identifierad variant och därmed underlätta användningen av den.