DNA:N KVANTIFIOINTITEKNIIKKA TULKINTATYÖKÄYNNISSÄ MITOKONDRITAAUTEISSA

2622/5000 Mitokondriaaliset sairaudet (MM) ovat yleisimpiä aineenvaihduntasairauksia. Koska nämä patologiat ovat kliinisesti hyvin heterogeenisiä, vain tumageenien tai mitokondrioiden DNA:n mutaatioiden tunnistaminen vahvistaa diagnoosin.

MtDNA:n täysimittainen tutkimus korkean suorituskyvyn sekvensoinnilla (NGS) on ensimmäinen askel diagnostisessa lähestymistavassa. Tämän vallankumouksellisen uuden teknologian äskettäinen käyttöönotto on lisännyt huomattavasti mutaatioiden tunnistamisen tehokkuutta. Kuitenkin tunnettujen patogeenisten mutaatioiden lisäksi NGS paljastaa lukuisia muunnelmia, joiden merkitystä ei tällä hetkellä tunneta. Suuri haaste luotettavan diagnoosin saamiseksi on siksi näiden uusien harvinaisten varianttien kliinisen vaikutuksen tulkinta, joka osoittautuu erittäin vaikeaksi.

Patogeenisuuskriteerit mahdollistavat muunnelmien luokittelun hyvänlaatuisista patogeenisiin. Yksi tärkeimmistä patogeenisyyskriteereistä on heteroplasmisen tason hyvä korrelaatio kudosten tai solujen osallistumisen kanssa. Itse asiassa mtDNA-mutaatiot ovat yleensä heteroplasmisia, mikä vastaa normaalien ja mutatoituneiden molekyylien rinnakkaiseloa samassa solussa tai kudoksessa, joista eniten kärsivillä kudoksilla on suuri mutaationopeus. Sairastuneen potilaan lihasbiopsiassa säikeissä esiintyy usein sytokromi-c-oksidaasin (COX-negatiivinen) entsyymipuutos, joka voidaan osoittaa immunohistokemialla. Yksikuitututkimuksen avulla voidaan eristää puutteelliset kuidut ja kvantifioida variantin heteroplasminen nopeus. Heteroplasman korkea taso COX-negatiivisissa kuiduissa, toisin kuin kuiduissa, joissa ei ole puutetta, on vahva argumentti tämän variantin patogeenisuuden puolesta. Tällä hetkellä tätä tekniikkaa ei käytetä rutiininomaisesti diagnostisissa laboratorioissa, vaan vain satunnaisesti tutkimuskehyksessä joissakin laboratorioissa. Se on raskas tekniikka, joka koostuu eri lihaskuitujen lasermikrodissektion ensimmäisestä vaiheesta, jota seuraa toisesta vaiheesta kunkin kuidun variantin kvantifiointi. Tämä toinen vaihe vaatii erityistä keskittymistä jokaiseen tunnistettuun muunnelmaan.

Tämän pilottitutkimuksen tavoitteena on kehittää uusi tekniikka NGS-lasermikrodissektiolla eristettyjen yksikuituisten heteroplasmioiden kvantifiointiin. Näin vältytään muunnelman tyypistä riippumatta pitkät ja kalliit säädöt, jotka vaaditaan jokaiselle tunnistetulle uudelle versiolle ja helpotetaan siten sen käyttöä.