Wpływ miomektomii na wyniki IVF

Metoda grupowania i zaślepiania Jest to ogólnokrajowe, wieloośrodkowe, randomizowane badanie kontrolowane. We wszystkich ośrodkach przeprowadzana jest rekrutacja konkurencyjna. Grupa badana otrzymała IVF po miomektomii, a grupa kontrolna została skierowana do IVF po rutynowej ocenie, prawdopodobnie obejmującej diagnostyczną laparoskopię. W tym badaniu 836 pacjentów podzielono losowo na 2 grupy po 418 pacjentów w każdej grupie zgodnie ze scentralizowanym systemem losowym. Losowa sekwencja jest generowana z losowym rozmiarem bloku o rozmiarze bloku równym 4.

Zbieranie danych klinicznych i próbek Dane i próbki są gromadzone zgodnie z formularzem Case Report Form (CRF), w tym z randomizacją, danymi epidemiologicznymi i klinicznymi. Ocena historii i szczegółów niepłodności, wyniki badań obrazowych, rezerwacja jajników i wyniki zabiegów chirurgicznych są szczególnie interesujące i szczegółowo rejestrowane.

Próbki krwi obwodowej, komórek złuszczonych szyjki macicy, komórek złuszczonych endometrium, biopsji endometrium i mięśniaka w grupie badanej pobiera się do analizy multiomicznej. Proces pobierania próbek nie powinien zakłócać ani pogarszać leczenia chirurgicznego i IVF.

Leczenie IVF: schemat IVF powinien zawierać szczegółowe zapisy planu regulacji w dół, liczby cykli, zamrożonych lub świeżych blastocyst, ①Grupa badana: leczenie IVF przeprowadza się 6 miesięcy po miomektomii, a pacjenci powinni być obserwowani przez 1 rok po rozpoczęciu IVF . W przypadku odsłonięcia endometrium podczas miomektomii, zabieg IVF wykonuje się 12 miesięcy po miomektomii. Należy zauważyć, że należy odnotować czas stosowania antykoncepcji pooperacyjnej, a także odstęp czasu między miomektomią a zapłodnieniem in vitro.

②Grupa kontrolna: Leczenie IVF przeprowadzono natychmiast po odpowiedniej ocenie i obserwacji przez 1 rok po rozpoczęciu IVF.

Badanie cech genomowych i analiza bioinformatyczna

1. Endometrial receptive array (ERA) to molekularny test diagnostyczny oparty na technologii mikromacierzy, który na podstawie ekspresji 238 wybranych genów dzieli biopsję endometrium na typy receptywne, przedrecepcyjne lub proliferacyjne. ER Map/ER Stage opiera się na ekspresji 184 genów zaangażowanych w matczyną odpowiedź immunologiczną związaną z proliferacją endometrium i implantacją zarodka.
2. Sekwencjonowanie metylacji: Wyodrębnij DNA związane z krwią obwodową, tkanką i komórkami oraz dokładnie określ stężenie DNA za pomocą Qubit 2.0. Całkowita ilość wykrytego DNA nie powinna być mniejsza niż 1 μg. Konstrukcja biblioteki: Po pomyślnym wykryciu próbki, 1 µg próbki genomowego DNA zmieszano z niemetylowanym DNA lambda przy użyciu systemu Biouptor, a następnie pofragmentowano do średniej wielkości około 250 bp. Po fragmentacji oczyszczone losowo pofragmentowane DNA zostało następnie naprawione, pasywowane i fosforylowane mieszaniną polimerazy DNA T4, fragmentu Klenowa i kinazy polinukleotydowej T4. Tępy fragment DNA poddano następnie 3'adenozylacji fragmentem Klenowa (3'-5'egzo-), a następnie połączono z łącznikiem łączącym 5'-metylocytozynę zamiast cytozyny przy użyciu ligazy DNA T4. Po zakończeniu każdego kroku użyj kulek magnetycznych do oczyszczenia DNA. Następnie użyj zestawu ZYMO EZ DNA methylation gold do przekształcenia niemetylowanej cytozyny w uracyl zgodnie z instrukcją. Na koniec użyć polimerazy DNA JumpStart Taq do amplifikacji PCR, a następnie użyć kulek magnetycznych do oczyszczenia produktu PCR w celu uzyskania ostatecznej biblioteki. Kontrola jakości biblioteki: Po zakończeniu budowy biblioteki przeprowadzana jest wstępna kwantyfikacja przy użyciu Qubit2.0, i bibliotekę rozcieńcza się do 1 ng/ul. Następnie rozmiar wstawki biblioteki jest testowany przy użyciu Agilent 2100. Gdy rozmiar insertu spełni oczekiwania, efektywne stężenie biblioteki jest dokładnie określane ilościowo przy użyciu metody qPCR (efektywne stężenie biblioteki >2nM), aby zapewnić jakość biblioteki. Sekwencjonowanie online: po pomyślnym wykryciu biblioteki różne biblioteki są łączone zgodnie z wymaganiami dotyczącymi efektywnego stężenia i docelowej objętości danych offline, a następnie sekwencjonowane na platformie Illumina Nova przy użyciu strategii sekwencjonowania PE150. Następnie przeprowadzono kontrolę jakości oryginalnych danych offline, porównanie sekwencji, obliczenie poziomu metylacji, identyfikację i statystykę zróżnicowanego regionu metylacji (DMR).

Wykrywanie białek w moczu i analiza bioinformatyczna

1. Technologia rozdziału białek: dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2DE), dwuwymiarowa fluorescencyjna elektroforeza różnicowa (2D-DIGE), elektroforeza z ogniskowaniem izoelektrycznym (IEF), chromatografia cieczowa; Chromatografia wielowymiarowa (MDC) (w tym chromatografia wykluczania, chromatografia jonowymienna, wysokosprawna chromatografia faz odwróconych, chromatografia oddziaływań hydrofobowych itp.) oraz wielowymiarowa chromatografia cieczowa (MDLC).
2. Technologia identyfikacji białek: pierwotna spektrometria mas: według różnych źródeł jonów można ją podzielić na spektrometrię mas z jonizacją z desorpcją matrycową wspomaganą laserem (MALDI-TOF-MS) i spektrometrię mas z rozpylaniem elektrycznym (ESI MS); Wtórna spektrometria mas: peptydowy odcisk palca (PMF); Nowa technologia: spektrometria biomasy z sygnaturami stabilnych nuklidów (SIAMS).
3. Identyfikacja segmentów peptydów białkowych: analiza końców aminowych i karboksylowych, np. Edmana; Spektrometria mas, w tym spektrometria mas fragmentów peptydów i tandemowa spektrometria mas.
4. Interakcje białek: technologia immunoprecypitacji, dwuhybrydowy system drożdży, technologia chipów białkowych.

Analiza Metabolomiki i Bioinformatyki

1. Tkankę endometrium natychmiast po wyizolowaniu zamrożono w ciekłym azocie, a następnie tkankę przechowywano w temperaturze -80 ℃, zmielono i zmiażdżono oraz ekstrahowano zimną organiczną ekstrakcją ciecz-ciecz. Należy zwrócić uwagę na unikanie zmian metabolicznych przed i podczas pobierania próbek. Przeprowadź analizę metabolomiczną na pobranych komórkach, tkankach, krwi i moczu.
2. Ekstrakcja metabolitów: Najczęściej stosowaną metodą ekstrakcji metabolitów jest wytrącanie białka rozpuszczalnikami organicznymi i ekstrakcja supernatantu poprzez szybkie wirowanie lub ultraszybką filtrację w celu usunięcia wytrąconych białek. Zatężyć stosując liofilizację lub przedmuchiwanie azotem i rozpuścić pozostałość w złożonym rozpuszczalniku.
3. Wykrywanie próbek: Pobierz pewną ilość ponownie rozpuszczonego supernatantu i użyj ultrawysokosprawnego systemu do chromatografii cieczowej Thermo Vanquish UHPLC oraz platformy spektrometrii mas Thermo Q Active HF-X do wykrywania maszynowego.
4. Przetwarzanie danych: Po zakończeniu wykrywania spektrometrii mas dane offline (. raw) jest importowany do oprogramowania wyszukującego w celu prostego sprawdzenia czasu retencji, współczynnika ładunku masowego i innych parametrów. Następnie, zgodnie z odchyleniem czasu retencji, odchyleniem jakości i odchyleniem siły sygnału, stosunkiem sygnału do szumu, minimalną siłą sygnału i innymi informacjami różnych próbek, przeprowadzane jest wyrównanie pików i ekstrakcja pików. W tym samym czasie obszar piku jest określany ilościowo, a następnie jony docelowe są integrowane w celu przewidzenia wzoru cząsteczkowego i porównania z bazą danych w celu uzyskania identyfikacji i wyników ilościowych danych. Dlatego nieukierunkowane bazy danych metabolomiki i oprogramowanie do wyszukiwania odgrywają decydującą rolę w wynikach eksperymentów. Jednak LC-MS ma bardzo niewiele publicznych baz danych, a większość z nich to bazy danych zbudowane na platformie. Powszechnie używane bazy danych obejmują HMDB, METLIN i niektóre samodzielnie zbudowane biblioteki.
5. Analiza informacji: analiza głównych składników, analiza różnicowa metabolitów itp.