L'impatto della miomectomia sugli esiti della fecondazione in vitro

Raggruppamento e metodo di accecamento Questo è uno studio nazionale multicentrico, randomizzato controllato. L'iscrizione competitiva viene eseguita tra tutti i centri. Il gruppo di studio ha ricevuto la fecondazione in vitro dopo la miomectomia e il gruppo di controllo è stato indirizzato alla fecondazione in vitro dopo la valutazione di routine, probabilmente includendo la laparoscopia diagnostica. In questo studio, 836 pazienti sono stati divisi casualmente in 2 gruppi con 418 pazienti in ciascun gruppo secondo il sistema casuale centralizzato. Viene generata una sequenza casuale con una dimensione di blocco casuale pari a 4.

Raccolta di dati clinici e campioni I dati ei campioni vengono raccolti secondo il modulo Case Report Form (CRF), comprese informazioni randomizzate, informazioni epidemiologiche e cliniche. La valutazione della storia e dei dettagli dell'infertilità, i risultati di imaging, la prenotazione ovarica e i risultati chirurgici sono di particolare interesse e registrati in modo dettagliato.

Campioni di sangue periferico, cellule esfoliate cervicali, cellule esfoliate endometriali, biopsia endometriale e mioma nel gruppo di studio vengono raccolti per l'analisi multi-omica. Il processo di prelievo del campione non dovrebbe interferire o deteriorare il trattamento chirurgico e di fecondazione in vitro.

Trattamento di fecondazione in vitro: il regime di fecondazione in vitro dovrebbe includere registrazioni dettagliate del piano di downregulation, numero di cicli, blastocisti congelate o fresche, ①Gruppo di studio: il trattamento di fecondazione in vitro viene eseguito 6 mesi dopo la miomectomia e i pazienti devono essere seguiti per 1 anno dopo l'inizio della fecondazione in vitro . Se l'endometrio è esposto durante la miomectomia, il trattamento di fecondazione in vitro viene eseguito 12 mesi dopo la miomectomia. Va notato che il tempo per la contraccezione postoperatoria dovrebbe essere registrato, e anche l'intervallo di tempo tra la miomectomia e la fecondazione in vitro.

②Gruppo di controllo: il trattamento di fecondazione in vitro è stato eseguito immediatamente dopo la valutazione pertinente e il follow-up per 1 anno dopo l'inizio della fecondazione in vitro.

Esame delle caratteristiche genomiche e analisi bioinformatica

1. L'array recettivo endometriale (ERA) è un test diagnostico molecolare basato sulla tecnologia dei microarray, che divide la biopsia endometriale in tipi ricettivi, pre-ricettivi o proliferativi basati sull'espressione di 238 geni selezionati. ER Map/ER Stage si basa sull'espressione di 184 geni coinvolti nella risposta immunitaria materna correlata alla proliferazione endometriale e all'impianto dell'embrione.
2. Sequenziamento della metilazione: estrarre il DNA correlato a sangue periferico, tessuti e cellule e quantificare accuratamente la concentrazione del DNA utilizzando Qubit 2.0. La quantità totale di DNA rilevata non deve essere inferiore a 1 ug. Costruzione della libreria: dopo aver superato il rilevamento del campione, 1 µ g di DNA genomico del campione è stato miscelato con DNA lambda non metilato utilizzando il sistema Biouptor e quindi frammentato a una dimensione media di circa 250 bp. Dopo la frammentazione, il DNA frammentato casualmente purificato è stato quindi riparato, passivato e fosforilato con una miscela di T4 DNA polimerasi, frammento di Klenow e T4 polinucleotide chinasi. Il frammento di DNA smussato è stato quindi 3' adenosilato con il frammento di Klenow (3' -5'exo -), e quindi collegato al linker che collega 5'-metil citosina invece di citosina utilizzando la DNA ligasi T4. Dopo aver completato ogni passaggio, utilizzare perline magnetiche per purificare il DNA. Quindi, utilizzare il kit ZYMO EZ DNA methylation gold per convertire la citosina non metilata in uracile secondo le istruzioni. Infine, utilizzare JumpStart Taq DNA polimerasi per l'amplificazione PCR, quindi utilizzare sfere magnetiche per purificare il prodotto PCR per ottenere la libreria finale. Ispezione della qualità della biblioteca: dopo che la costruzione della biblioteca è stata completata, la quantificazione preliminare viene eseguita utilizzando Qubit2.0, e la libreria è diluita a 1ng/ul. Quindi, la dimensione dell'inserto della libreria viene testata utilizzando Agilent 2100. Dopo che la dimensione dell'inserto soddisfa le aspettative, la concentrazione effettiva della libreria viene accuratamente quantificata utilizzando il metodo qPCR (concentrazione effettiva della libreria> 2nM) per garantire la qualità della libreria. Sequenziamento online: dopo aver superato il rilevamento della libreria, diverse librerie vengono raggruppate in pool in base alla concentrazione effettiva e ai requisiti del volume di dati offline target, quindi sequenziate sulla piattaforma Illumina Nova utilizzando la strategia di sequenziamento PE150. Successivamente, sono stati effettuati il ​​controllo di qualità dei dati offline originali, il confronto delle sequenze, il calcolo del livello di metilazione, l'identificazione e le statistiche della regione di metilazione differenziale (DMR).

Rilevazione delle proteine ​​urinarie e analisi bioinformatica

1. Tecnologia di separazione delle proteine: elettroforesi su gel bidimensionale (2DE), elettroforesi differenziale a fluorescenza bidimensionale (2D-DIGE), elettroforesi isoelettrica a focalizzazione (IEF), cromatografia liquida; Cromatografia multidimensionale (MDC) (compresa la cromatografia ad esclusione dimensionale, la cromatografia a scambio ionico, la cromatografia ad alte prestazioni in fase inversa, la cromatografia a interazione idrofobica, ecc.) e la cromatografia liquida multidimensionale (MDLC).
2. Tecnologia di identificazione delle proteine: spettrometria di massa primaria: in base alle diverse sorgenti ioniche, può essere suddivisa in spettrometria di massa di volo con desorbimento laser assistito da matrice (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa a spruzzo elettrico (ESI MS); Spettrometria di massa secondaria: peptide mass fingerprint (PMF); Nuova tecnologia: Spettrometria di biomassa a firma di nuclidi stabili (SIAMS).
3. Identificazione di segmenti proteici peptidici: analisi delle estremità ammino e carbossiliche, come Edman; Spettrometria di massa, compresa la spettrometria di massa dei frammenti peptidici e la spettrometria di massa tandem.
4. Interazioni proteiche: tecnologia di immunoprecipitazione, sistema ibrido a due lieviti, tecnologia dei chip proteici.

Metabolomica e analisi bioinformatica

1. Il tessuto endometriale è stato immediatamente congelato in azoto liquido dopo essere stato isolato, quindi il tessuto è stato conservato a -80 ℃, macinato e frantumato ed estratto con estrazione liquido-liquido organico a freddo. Occorre prestare attenzione per evitare cambiamenti metabolici prima e durante il campionamento. Eseguire l'analisi metabolomica su cellule, tessuti, sangue e urina raccolti.
2. Estrazione dei metaboliti: il metodo più comunemente utilizzato nell'estrazione dei metaboliti consiste nel precipitare le proteine ​​con solventi organici ed estrarre il surnatante mediante centrifugazione ad alta velocità o filtrazione ultraveloce per rimuovere la precipitazione delle proteine. Concentrare mediante liofilizzazione o insufflaggio di azoto e sciogliere il residuo in un solvente complesso.
3. Rilevamento del campione: prelevare una certa quantità di supernatante ridisciolto e utilizzare il sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni Thermo Vanquish UHPLC e la piattaforma di spettrometria di massa Thermo Q Active HF-X per il rilevamento della macchina.
4. Elaborazione dei dati: dopo che il rilevamento della spettrometria di massa è stato completato, i dati offline (. raw) viene importato nel software di ricerca per un semplice screening del tempo di ritenzione, del rapporto di carica di massa e di altri parametri. Quindi, in base alla deviazione del tempo di ritenzione, alla deviazione della qualità e alla deviazione dell'intensità del segnale, al rapporto segnale/rumore, all'intensità minima del segnale e ad altre informazioni di diversi campioni, vengono eseguiti l'allineamento del picco e l'estrazione del picco. Allo stesso tempo, l'area del picco viene quantificata, quindi gli ioni bersaglio vengono integrati per prevedere la formula molecolare e confrontarla con il database per ottenere l'identificazione e i risultati quantitativi dei dati. Pertanto, i database di metabolomica non mirati e il software di ricerca giocano un ruolo decisivo nei risultati sperimentali. Tuttavia, LC-MS ha pochissimi database pubblici e la maggior parte di essi sono database costruiti su piattaforma. I database comunemente usati includono HMDB, METLIN e alcune librerie autocostruite.
5. Analisi delle informazioni: analisi dei componenti principali, analisi dei metaboliti differenziali, ecc.