El impacto de la miomectomía en los resultados de la FIV

Método de agrupamiento y cegamiento Este es un estudio controlado aleatorizado multicéntrico nacional. La inscripción competitiva se realiza entre todos los centros. El grupo de estudio recibió FIV después de la miomectomía y el grupo de control fue dirigido a FIV después de la evaluación de rutina, probablemente incluida la laparoscopia diagnóstica. En este estudio, 836 pacientes se dividieron aleatoriamente en 2 grupos con 418 pacientes en cada grupo según el sistema aleatorio centralizado. Se genera una secuencia aleatoria con un tamaño de bloque aleatorio de un tamaño de bloque de 4.

Recopilación de datos clínicos y muestras Los datos y las muestras se recopilan de acuerdo con el Formulario de informe de casos (CRF), que incluye información aleatoria, epidemiológica y clínica. La evaluación de la historia y los detalles de la infertilidad, los resultados de las imágenes, la reserva ovárica y los hallazgos quirúrgicos son de especial interés y se registran detalladamente.

Se recolectan muestras de sangre periférica, células exfoliadas cervicales, células exfoliadas endometriales, biopsia endometrial y mioma en el grupo de estudio para análisis multiómicos. El proceso de recolección de muestras no debe interferir o deteriorar el tratamiento quirúrgico y de FIV.

Tratamiento de FIV: el régimen de FIV debe incluir registros detallados del plan de regulación a la baja, número de ciclos, blastocistos congelados o frescos, ①Grupo de estudio: el tratamiento de FIV se realiza 6 meses después de la miomectomía, y se debe realizar un seguimiento de los pacientes durante 1 año después del inicio de la FIV . Si el endometrio queda expuesto durante la miomectomía, el tratamiento de FIV se realiza 12 meses después de la miomectomía. Cabe señalar que se debe registrar el tiempo de anticoncepción posoperatoria, así como el intervalo de tiempo entre la miomectomía y la FIV.

②Grupo de control: el tratamiento de FIV se realizó inmediatamente después de la evaluación relevante y el seguimiento durante 1 año después del inicio de la FIV.

Examen de características genómicas y análisis bioinformático

1. La matriz receptiva endometrial (ERA) es una prueba de diagnóstico molecular basada en la tecnología de microarrays, que divide la biopsia endometrial en tipos receptivos, prerreceptivos o proliferativos según la expresión de 238 genes seleccionados. ER Map/ER Stage se basa en la expresión de 184 genes implicados en la respuesta inmunitaria materna relacionada con la proliferación endometrial y la implantación embrionaria.
2. Secuenciación de metilación: extraiga ADN relacionado con sangre periférica, tejidos y células, y cuantifique con precisión la concentración de ADN utilizando Qubit 2.0. La cantidad total de ADN detectada no debe ser inferior a 1ug. Construcción de la biblioteca: después de pasar la detección de la muestra, se mezcló 1 µg de ADN genómico de muestra con ADN lambda no metilado usando el sistema Biouptor y luego se fragmentó a un tamaño promedio de aproximadamente 250 pb. Después de la fragmentación, el ADN fragmentado al azar purificado fue reparado, pasivado y fosforilado con una mezcla de ADN polimerasa T4, fragmento Klenow y polinucleótido quinasa T4. El fragmento de ADN romo se adenosiló luego en 3' con el fragmento Klenow (3'-5'exo-), y luego se unió al enlazador que conecta 5'-metilcitosina en lugar de citosina usando ADN ligasa T4. Después de completar cada paso, use perlas magnéticas para purificar el ADN. Luego, use el kit de oro de metilación de ADN ZYMO EZ para convertir la citosina no metilada en uracilo de acuerdo con las instrucciones. Por último, utilice la polimerasa de ADN JumpStart Taq para la amplificación por PCR y, a continuación, utilice perlas magnéticas para purificar el producto de la PCR y obtener la biblioteca final. Inspección de calidad de la biblioteca: una vez completada la construcción de la biblioteca, se lleva a cabo una cuantificación preliminar utilizando Qubit2.0, y la biblioteca se diluye a 1 ng/ul. Luego, el tamaño de inserción de la biblioteca se prueba con Agilent 2100. Una vez que el tamaño del inserto cumple con las expectativas, la concentración efectiva de la biblioteca se cuantifica con precisión mediante el método qPCR (concentración efectiva de la biblioteca> 2 nM) para garantizar la calidad de la biblioteca. Secuenciación en línea: después de pasar la detección de la biblioteca, se agrupan diferentes bibliotecas de acuerdo con la concentración efectiva y los requisitos de volumen de datos fuera de línea de destino, y luego se secuencian en la plataforma Illumina Nova utilizando la estrategia de secuenciación PE150. Después de eso, se llevaron a cabo el control de calidad de los datos originales fuera de línea, la comparación de secuencias, el cálculo del nivel de metilación, la identificación y las estadísticas de la región de metilación diferencial (DMR).

Detección de proteínas urinarias y análisis bioinformático

1. Tecnología de separación de proteínas: electroforesis en gel bidimensional (2DE), electroforesis diferencial de fluorescencia bidimensional (2D-DIGE), electroforesis de enfoque isoeléctrico (IEF), cromatografía líquida; Cromatografía multidimensional (MDC) (que incluye cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de alta resolución de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba, etc.) y cromatografía líquida multidimensional (MDLC).
2. Tecnología de identificación de proteínas: espectrometría de masas primaria: de acuerdo con las diferentes fuentes de iones, se puede dividir en espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) y espectrometría de masas de pulverización eléctrica (ESI MS); Espectrometría de masas secundaria: huella dactilar de masas peptídicas (PMF); Nueva tecnología: Espectrometría de biomasa de firma de nucleidos estables (SIAMS).
3. Identificación de segmentos peptídicos de proteínas: análisis de extremos amino y carboxilo, como Edman; Espectrometría de masas, incluida la espectrometría de masas de fragmentos peptídicos y la espectrometría de masas en tándem.
4. Interacciones de proteínas: tecnología de inmunoprecipitación, sistema de dos híbridos de levadura, tecnología de chips de proteínas.

Análisis Metabolómico y Bioinformático

1. El tejido del endometrio se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido después de ser aislado, y luego el tejido se almacenó a -80 ℃, se trituró y trituró, y se extrajo con extracción líquido-líquido orgánico frío. Se debe prestar atención para evitar cambios metabólicos antes y durante el muestreo. Realice análisis de metabolómica en células recolectadas, tejidos, sangre y orina.
2. Extracción de metabolitos: el método más utilizado en la extracción de metabolitos es precipitar proteínas con disolventes orgánicos y extraer el sobrenadante mediante centrifugación de alta velocidad o filtración ultrarrápida para eliminar la precipitación de proteínas. Concentrar usando liofilización o soplado de nitrógeno y disolver el residuo en un solvente complejo.
3. Detección de muestras: tome una determinada cantidad de sobrenadante redisuelto y utilice el sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Thermo Vanquish UHPLC y la plataforma de espectrometría de masas Thermo Q Active HF-X para la detección automática.
4. Procesamiento de datos: una vez completada la detección de espectrometría de masas, los datos fuera de línea (. raw) se importa al software de búsqueda para una detección simple del tiempo de retención, la relación de carga de masa y otros parámetros. Luego, de acuerdo con la desviación del tiempo de retención, la desviación de la calidad y la desviación de la intensidad de la señal, la relación señal/ruido, la intensidad mínima de la señal y otra información de diferentes muestras, se lleva a cabo la alineación de picos y la extracción de picos. Al mismo tiempo, se cuantifica el área del pico y luego se integran los iones objetivo para predecir la fórmula molecular y compararla con la base de datos para obtener la identificación y los resultados cuantitativos de los datos. Por lo tanto, las bases de datos de metabolómica no dirigida y el software de búsqueda juegan un papel decisivo en los resultados experimentales. Sin embargo, LC-MS tiene muy pocas bases de datos públicas, y la mayoría de ellas son bases de datos creadas por plataformas. Las bases de datos comúnmente utilizadas incluyen HMDB, METLIN y algunas bibliotecas autoconstruidas.
5. Análisis de información: análisis de componentes principales, análisis diferencial de metabolitos, etc.