O impacto da miomectomia nos resultados da fertilização in vitro

Método de agrupamento e cegamento Este é um estudo nacional, multicêntrico, randomizado e controlado. A inscrição competitiva é realizada entre todos os centros. O grupo de estudo recebeu FIV após miomectomia e o grupo controle foi direcionado para FIV após avaliação de rotina, provavelmente incluindo laparoscopia diagnóstica. Neste estudo, 836 pacientes foram divididos aleatoriamente em 2 grupos com 418 pacientes em cada grupo de acordo com o sistema aleatório centralizado. Uma sequência aleatória é gerada com um tamanho de bloco aleatório de um tamanho de bloco de 4.

Coleta de dados clínicos e amostras Os dados e amostras são coletados de acordo com o formulário Case Report Form (CRF), incluindo informações randomizadas, epidemiológicas e clínicas. A avaliação da história e detalhes da infertilidade, resultados de imagem, reserva ovariana e achados cirúrgicos são de interesse especial e registrados detalhadamente.

Amostras de sangue periférico, células esfoliadas cervicais, células esfoliadas endometriais, biópsia endometrial e mioma no grupo de estudo são coletadas para análise multiômica. O processo de coleta de amostras não deve interferir ou deteriorar o tratamento cirúrgico e de fertilização in vitro.

Tratamento de fertilização in vitro: o regime de fertilização in vitro deve incluir registros detalhados do plano de regulação negativa, número de ciclos, blastocistos congelados ou frescos, ①Grupo de estudo: o tratamento de fertilização in vitro é realizado 6 meses após a miomectomia e os pacientes devem ser acompanhados por 1 ano após o início da fertilização in vitro . Se o endométrio for exposto durante a miomectomia, o tratamento de fertilização in vitro é realizado 12 meses após a miomectomia. Ressalta-se que o tempo de contracepção pós-operatória deve ser registrado, assim como o intervalo de tempo entre a miomectomia e a FIV.

②Grupo controle: o tratamento de fertilização in vitro foi realizado imediatamente após avaliação relevante e acompanhamento por 1 ano após o início da fertilização in vitro.

Exame de características genômicas e análise de bioinformática

1. Endometrial receptivo array (ERA) é um teste de diagnóstico molecular baseado na tecnologia de microarray, que divide a biópsia endometrial em tipos receptivos, pré-receptivos ou proliferativos com base na expressão de 238 genes selecionados. ER Map/ER Stage é baseado na expressão de 184 genes envolvidos na resposta imune materna relacionada à proliferação endometrial e implantação embrionária.
2. Sequenciamento de metilação: extraia DNA relacionado ao sangue periférico, tecido e células e quantifique com precisão a concentração de DNA usando o Qubit 2.0. A quantidade total de DNA detectado não deve ser inferior a 1 ug. Construção da biblioteca: Depois de passar pela detecção da amostra, 1 µg de DNA genômico da amostra foi misturado com DNA lambda não metilado usando o sistema Biouptor e, em seguida, fragmentado em um tamanho médio de aproximadamente 250bp. Após a fragmentação, o DNA fragmentado aleatório purificado foi então reparado, passivado e fosforilado com uma mistura de T4 DNA polimerase, fragmento Klenow e T4 polinucleotídeo quinase. O fragmento cego de DNA foi então 3' adenosilado com o fragmento Klenow (3' -5'exo -), e então ligado ao ligante conectando 5'- metil citosina em vez de citosina usando T4 DNA ligase. Depois de concluir cada etapa, use esferas magnéticas para purificar o DNA. Em seguida, use o kit ZYMO EZ DNA methylation gold para converter Citosina não metilada em Uracil de acordo com as instruções. Por fim, use a polimerase de DNA JumpStart Taq para amplificação por PCR e, em seguida, use esferas magnéticas para purificar o produto de PCR para obter a biblioteca final. Inspeção de qualidade da biblioteca: Após a conclusão da construção da biblioteca, a quantificação preliminar é realizada usando o Qubit2.0, e a biblioteca é diluída para 1 ng/ul. Em seguida, o tamanho do inserto da biblioteca é testado usando Agilent 2100. Depois que o tamanho da inserção atende às expectativas, a concentração efetiva da biblioteca é quantificada com precisão usando o método qPCR (concentração efetiva da biblioteca> 2nM) para garantir a qualidade da biblioteca. Sequenciamento on-line: depois de passar pela detecção da biblioteca, diferentes bibliotecas são reunidas de acordo com a concentração efetiva e os requisitos de volume de dados off-line de destino e, em seguida, sequenciadas na plataforma Illumina Nova usando a estratégia de sequenciamento PE150. Depois disso, foi realizado o controle de qualidade dos dados off-line originais, comparação de sequências, cálculo do nível de metilação, identificação e estatística da região de metilação diferencial (DMR).

Detecção de proteína urinária e análise bioinformática

1. Tecnologia de separação de proteínas: eletroforese em gel bidimensional (2DE), eletroforese diferencial de fluorescência bidimensional (2D-DIGE), eletroforese de focalização isoelétrica (IEF), cromatografia líquida; Cromatografia multidimensional (MDC) (incluindo cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de alta performance de fase reversa, cromatografia de interação hidrofóbica, etc.) e cromatografia líquida multidimensional (MDLC).
2. Tecnologia de identificação de proteínas: espectrometria de massa primária: de acordo com diferentes fontes de íons, pode ser dividida em espectrometria de massa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa por spray elétrico (ESI MS); Espectrometria de massa secundária: impressão digital de massa de peptídeos (PMF); Nova tecnologia: Espectrometria de massa biológica de assinatura de nuclídeo estável (SIAMS).
3. Identificação de segmentos de peptídeos de proteínas: análise de amino e carboxila, como Edman; Espectrometria de massa, incluindo espectrometria de massa de fragmentos peptídicos e espectrometria de massa em tandem.
4. Interações de proteínas: tecnologia de imunoprecipitação, sistema híbrido de dois fermentos, tecnologia de chips de proteínas.

Análise Metabolômica e Bioinformática

1. O tecido do endométrio foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido após ser isolado e, em seguida, o tecido foi armazenado a -80 ℃, moído e triturado e extraído com extração líquida orgânica fria. Deve-se prestar atenção para evitar alterações metabólicas antes e durante a amostragem. Realize análises metabolômicas em células, tecidos, sangue e urina coletados.
2. Extração de metabólitos: O método mais comumente usado na extração de metabólitos é precipitar proteínas com solventes orgânicos e extrair o sobrenadante por meio de centrifugação de alta velocidade ou filtração ultrarrápida para remover a precipitação de proteínas. Concentrar usando liofilização ou sopro de nitrogênio e dissolver o resíduo em um solvente complexo.
3. Detecção de amostra: Pegue uma certa quantidade de sobrenadante redissolvido e use o sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho Thermo Vanquish UHPLC e a plataforma de espectrometria de massa Thermo Q Active HF-X para detecção de máquina.
4. Processamento de dados: Após a conclusão da detecção por espectrometria de massa, os dados offline (. raw) é importado para o software de pesquisa para triagem simples do tempo de retenção, taxa de carga em massa e outros parâmetros. Em seguida, de acordo com o desvio do tempo de retenção, desvio de qualidade e desvio da intensidade do sinal, relação sinal-ruído, intensidade mínima do sinal e outras informações de diferentes amostras, o alinhamento e a extração do pico são realizados. Ao mesmo tempo, a área do pico é quantificada e, em seguida, os íons alvo são integrados para prever a fórmula molecular e comparar com o banco de dados para obter a identificação e os resultados quantitativos dos dados. Portanto, bancos de dados metabolômicos não direcionados e software de pesquisa desempenham um papel decisivo nos resultados experimentais. No entanto, LC-MS tem muito poucos bancos de dados públicos, e a maioria deles são bancos de dados construídos em plataforma. Os bancos de dados comumente usados ​​incluem HMDB, METLIN e algumas bibliotecas autoconstruídas.
5. Análise de informações: análise de componentes principais, análise diferencial de metabólitos, etc.