Pierwotne i wtórne mutacje lekooporności (DRM) wirusa HIV jako czynnik ryzyka niepowodzenia terapii ART, w tym dwóch schematów leczenia opartych na lekach.

Wprowadzenie Obecność mutacji lekoopornych (DRM) w wirusie HIV odgrywa ważną rolę w skuteczności ART. Pomimo bardzo dobrych wyników ART, istnieje ciągła obawa o pojawienie się szczepów HIV z DRM, co może prowadzić do niepowodzenia supresji wirusologicznej. Pierwotne DRM HIV występują u PLWH, które nie były wcześniej leczone ART. Osoby te rozpoczynają leczenie z niższą barierą genetyczną, większym ryzykiem niepowodzenia wirusologicznego i większym ryzykiem rozwoju oporności na inne leki, co może prowadzić do progresji do AIDS. Obawy rosną szczególnie wśród pacjentów leczonych dwoma schematami lekowymi, w tym długo działającymi terapiami w postaci zastrzyków (LAI ART) lub schematami stosowanymi w profilaktyce przedekspozycyjnej (PreP). Częstość występowania głównych DRM HIV-1 zgłaszanych na całym świecie waha się od 5 do 25%, natomiast w przypadku dodatkowych (polimorficznych) DRM nawet do 50%. Donoszono, że w krajach o wysokich dochodach częstość występowania sekwencji z nabytymi DRM maleje, ale odsetek przenoszonej odporności wyraźnie wzrasta w porównaniu do odsetka nabytych DRM, osiągając nawet 70% wszystkich przypadków DRM.

Cel badania Wybór ART opiera się na danych epidemiologicznych dotyczących obecności mutacji lekoopornych u wirusa HIV, a także na podstawie wyników badań genotypu HIV ocenianych przed rozpoczęciem lub zmianą leczenia. Obecność DRM przed rozpoczęciem ART może być czynnikiem ryzyka niewystarczającej supresji wirusologicznej, ponieważ populacja wirusa HIV wciąż ewoluuje (zmiana wynika z błędów w procesie replikacji). Ponadto nieodpowiednia terapia antyretrowirusowa może doprowadzić populację wirusową najpierw do niższego, a następnie do wyższego poziomu sprawności. W związku z ciągłymi zmianami w schemacie lekooporności wirusa HIV (pojawienie się nowych mutacji) oraz wprowadzaniem do leczenia nowych leków, w tym dwóch schematów lekowych jak LAI ART, zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie badania, które określi rodzaj i częstość występowania DRM (m.in. NRTI i NNRTI – RPV, 3TC oraz InSTI – CAB, DTG) w populacji pacjentów wcześniej nieleczonych, a także wśród pacjentów z niepowodzeniem wirusologicznym ART. Wyniki mogą pomóc w ocenie ryzyka niepowodzenia ART, w tym LAI, oraz w ustaleniu schematu ART.

Metodologia Naszym celem jest prowadzenie wieloośrodkowych, obserwacyjnych, przekrojowych badań. Dane pacjentów zostaną pobrane z okresu 2 lat (2023–2024). Miejscem rekrutacji będą trzy ośrodki kliniczne w Polsce (dwa w Warszawie, jeden w Ostródzie). Kryteriami włączenia są: diagnoza zakażenia wirusem HIV-1, wiek 18 lat lub więcej. Będziemy zbierać dane epidemiologiczne takie jak: wiek, płeć, BMI, droga zakażenia, a także wyniki kliniczne i laboratoryjne: wiremia HIV, liczba limfocytów CD4 i stosunek CD4:CD8 (w momencie diagnozy/zmiany terapii), obecność AIDS -definiowanie chorób, wdrożony schemat ART. U wszystkich pacjentów, przed rozpoczęciem ART, zostanie oceniona obecność DRM wirusa HIV-1 w nukleozydowych inhibitorach odwrotnej transkryptazy (NRTI), nienukleozydowych inhibitorach odwrotnej transkryptazy (NNRTI), inhibitorach proteazy (PI) i inhibitorach integrazy (InSTI), jako część rutynowej pielęgnacji.

Genotypowanie lekooporności regionu kodującego proteazę HIV-1 (PR) i odwrotną transkryptazę (RT) zostanie przeprowadzone w oparciu o metodę sekwencjonowania Sangera z wykorzystaniem dostępnego na rynku systemu genotypowania ViroSeq HIV-1 Genotyping System (Abbott Molecular, Des Plains, IL, USA). ). Procedura analizy zostanie przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta. RNA HIV-1 zostanie wyekstrahowane ręcznie z 0,5 ml pobranych próbek osocza poprzez etapy wytrącania i wirowania, a następnie odwrotną transkrypcję przy użyciu odwrotnej transkryptazy MuLV. Produkty DNA odpowiadające fragmentowi regionu pol o długości 1,8 kb zostaną wygenerowane w reakcji PCR z użyciem polimerazy DNA AmpliTaq Gold, po wstępnej inkubacji z enzymem Uracil-N-Glikozylazą (UNG). Tam, gdzie będzie sekwencjonowany region kodujący integrazę HIV-1, zastosowany zostanie system genotypowania integrazy HIV-1 ViroSeq (Celera Diagnostics, Alameda, Kalifornia, USA) z jednoetapową reakcją amplifikacji RT-PCR. Otrzymane produkty PCR zostaną oczyszczone enzymatycznie poprzez inkubację z mieszaniną Exo-SAP (egzonukleaza I + fosfataza alkaliczna krewetek), w razie potrzeby rozcieńczone, znakowane fluorescencyjnie w reakcji z odpowiednimi terminatorami i sekwencjonowane za pomocą analizatora genetycznego ABI Prism 3130 Genetic Analyzer przy użyciu oprogramowania Data Collection Software (Applied Biosystems). . Powstałe chromatogramy sekwencji zostaną złożone i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania ViroSeq Genotyping System Software (Abbott Molecular). Zidentyfikowane zostaną mutacje związane z opornością na leki w proteazie, integrazie i odwrotnej transkryptazie. Ważne, sprawdzone pod względem jakości sekwencje pol zostaną przesłane do bazy danych oporności na leki HIV Uniwersytetu Stanforda (http://hivdb.stanford.edu) w celu porównania potencjalnych różnic w interpretacji znaczenia wykrytych wariantów genetycznych. W przypadku podtypu HIV-1 i form rekombinantu kołowego (CRF) określenie częściowych sekwencji przesłanych przez pol zostanie użyte narzędzie REGA HIV-1 Subtyping Tool w wersji 3.0.

Ocena statystyczna zebranych danych zostanie przeprowadzona w podgrupach PLWH z obecnością pierwotnych i wtórnych DRM HIV. Analiza zostanie przeprowadzona również w podgrupach pacjentów z różnym podtypem zakażenia HIV-1. W celu sprawdzenia normalności rozkładów analizowanych zmiennych zostanie przeprowadzony test Shapiro-Wilka. Do oceny różnicy wartości średnich w zmiennych ciągłych wykorzystany zostanie test t-Studenta lub test U Manna-Whitneya, a dla zmiennych kategorycznych zostaną przeprowadzone testy χ2 lub dokładny test Fishera. Wartość p <0,05 będzie uważana za istotną statystycznie. Analizy statystyczne zostaną wykonane przy użyciu oprogramowania Python 3.7 i programu Statistica 13.1 (StatSoft Polska, Kraków, Polska).

Badanie kliniczne uzyskało pozytywną opinię Komisji Bioetyki Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (numer zgody: AKBE/72/2023). Wszystkie analizowane dane pacjentów będą w pełni anonimowe. W opracowaniu zastosowano zasady Deklaracji Helsińskiej.