Mutazioni primarie e secondarie di resistenza ai farmaci (DRM) nell'HIV come fattore di rischio di fallimento dell'ART, inclusi due regimi basati su farmaci.

Introduzione La presenza di mutazioni di resistenza ai farmaci (DRM) nell'HIV gioca un ruolo importante nell'efficacia dell'ART. Nonostante gli ottimi risultati della terapia antiretrovirale, vi è una costante preoccupazione per la comparsa di ceppi di HIV con DRM, che potrebbero portare al fallimento della soppressione virologica. I DRM primari per l'HIV si verificano in pazienti affetti da HIV che non sono stati precedentemente trattati con ART. Queste persone iniziano il trattamento con una barriera genetica più bassa, un rischio più elevato di fallimento virologico e un rischio più elevato di sviluppare resistenza ad altri farmaci, che può portare alla progressione verso l'AIDS. Le preoccupazioni crescono soprattutto tra i pazienti trattati con regimi a base di due farmaci, comprese terapie iniezioni a lunga durata d’azione (LAI ART) o regimi utilizzati nella profilassi pre-esposizione (PreP). La prevalenza dei principali DRM HIV-1 segnalati a livello mondiale varia dal 5 al 25%, mentre nel caso dei DRM accessori (polimorfici) arriva anche al 50%. È stato riportato che nei paesi ad alto reddito la prevalenza di sequenze con DRM acquisiti sta diminuendo, ma la frazione di resistenza trasmessa è chiaramente in aumento rispetto alla frazione di DRM acquisiti, raggiungendo addirittura il 70% di tutti i casi di DRM.

Scopo dello studio La scelta dell'ART si basa sui dati epidemiologici relativi alla presenza di mutazioni di resistenza ai farmaci nell'HIV, nonché sulla base dei risultati del test di genotipizzazione dell'HIV valutati prima dell'inizio o del cambiamento del trattamento. La presenza di DRM prima dell’inizio dell’ART può essere un fattore di rischio per un’insufficiente soppressione virologica, poiché la popolazione dell’HIV è ancora in evoluzione (cambiando a causa di errori durante il processo di replicazione). Inoltre, una terapia antiretrovirale inadeguata può portare la popolazione virale dapprima a un livello di fitness inferiore e poi a un livello di fitness più elevato. A causa dei continui cambiamenti nel modello di resistenza ai farmaci per l’HIV (comparsa di nuove mutazioni) e dell’introduzione di nuovi farmaci nel trattamento, inclusi due regimi a base di farmaci come LAI ART, abbiamo deciso di condurre uno studio per determinare il tipo e la frequenza di DRM (compresi NRTI e NNRTI - RPV, 3TC e InSTI - CAB, DTG), nella popolazione di pazienti precedentemente non trattati, nonché tra i pazienti con fallimento virologico ART. I risultati possono aiutare a valutare il rischio di fallimento della ART, compresa la LAI, e a determinare i regimi di ART.

Metodologia Il nostro obiettivo è condurre uno studio multicentrico, osservazionale e trasversale. I dati dei pazienti verranno estratti dal periodo di 2 anni (2023 - 2024). La sede del reclutamento saranno tre centri clinici in Polonia (due a Varsavia, uno a Ostróda). I criteri di inclusione sono: diagnosi di infezione da HIV-1, età pari o superiore a 18 anni. Raccoglieremo dati epidemiologici quali: età, sesso, BMI, via di trasmissione anche dati clinici e di laboratorio: carica virale dell'HIV, conta dei linfociti CD4 e rapporto CD4:CD8 (al momento della diagnosi/cambio di terapia), presenza di AIDS -definizione delle malattie, implementazione del regime ART. In tutti i pazienti, prima di iniziare la ART, verrà valutata la presenza di DRM dell'HIV-1 rispetto agli inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa (NRTI), agli inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTI), agli inibitori della proteasi (PI) e agli inibitori dell'integrasi (InSTI). parte delle cure di routine.

La genotipizzazione della resistenza ai farmaci della regione codificante della proteasi (PR) e della trascrittasi inversa (RT) dell'HIV-1 sarà eseguita sulla base di un metodo di sequenziamento Sanger con l'uso del sistema di genotipizzazione ViroSeq HIV-1 disponibile in commercio (Abbott Molecular, Des Plains, IL, USA ). La procedura di analisi verrà eseguita secondo le istruzioni del produttore. L'RNA dell'HIV-1 verrà estratto manualmente da 0,5 mL di campioni di plasma raccolti mediante fasi di precipitazione e centrifugazione, seguite da trascrizione inversa con trascrittasi inversa MuLV. I prodotti di DNA corrispondenti al frammento della regione pol da 1,8 kb saranno generati in PCR con AmpliTaq Gold DNA Polymerase, dopo pre-incubazione con l'enzima Uracil-N-Glycosylase (UNG). Laddove verrà sequenziata la regione codificante dell'integrasi dell'HIV-1, verrà applicato il sistema di genotipizzazione dell'integrasi HIV-1 ViroSeq (Celera Diagnostics, Alameda, CA, USA) con una reazione di amplificazione RT-PCR in una fase. I prodotti della PCR ottenuti verranno purificati enzimaticamente mediante incubazione con la miscela Exo-SAP (esonucleasi I + fosfatasi alcalina di gamberetti), diluiti se necessario, marcati in modo fluorescente in reazione con terminatori appropriati e sequenziati mediante ABI Prism 3130 Genetic Analyser utilizzando il software Data Collection (Applied Biosystems) . I cromatogrammi di sequenza risultanti verranno assemblati e analizzati utilizzando il software ViroSeq Genotyping System (Abbott Molecular). Verranno identificate mutazioni associate alla resistenza ai farmaci nella proteasi, nell'integrasi e nella trascrittasi inversa. Le sequenze pol valide e di qualità controllata verranno inviate al database della resistenza ai farmaci HIV dell'Università di Stanford (http://hivdb.stanford.edu) al fine di confrontare le potenziali differenze nell'interpretazione del significato delle varianti genetiche rilevate. Per il sottotipo HIV-1 e le forme ricombinanti circolari (CRF) verrà utilizzata la determinazione delle sequenze pol parziali inviate dal REGA HIV-1 Subtyping Tool versione 3.0.

La valutazione statistica dei dati raccolti sarà effettuata in sottogruppi di PLWH con la presenza di DRM HIV primari e secondari. L'analisi verrà effettuata anche nei sottogruppi di pazienti con diversi sottotipi di infezione da HIV-1. Verrà effettuato il test di Shapiro-Wilk per la verifica della normalità delle distribuzioni nelle variabili analizzate. Verrà utilizzato il test t di Student o il test U di Mann-Whitney per valutare la differenza nel valore medio nelle variabili continue e verranno eseguiti i test χ 2 o Fisher esatti per le variabili categoriali. Un valore p <0,05 sarà considerato statisticamente significativo. Le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando il software Python 3.7 e il programma Statistica 13.1 (StatSoft Polonia, Cracovia, Polonia).

La sperimentazione clinica ha ricevuto un parere positivo dal Comitato di Bioetica dell'Università di Medicina di Varsavia (numero di consenso: AKBE/72/2023). Tutti i dati dei pazienti analizzati saranno completamente anonimizzati. Lo studio segue i principi della Dichiarazione di Helsinki.