Carga Mutacional de Tumores em Pacientes com Câncer de Pulmão (MUBULUC)

1. Conhecimento atual sobre o campo sob investigação

   Evidências clínicas demonstram que o tratamento com agentes bloqueadores do ponto de controle imunológico (ICB) beneficia os pacientes em vários tipos de tumor. No entanto, o desenvolvimento de biomarcadores preditivos é necessário para identificar pacientes com maior probabilidade de responder à imunoterapia.

   Um biomarcador emergente para resposta à imunoterapia é o número total de mutações presentes em uma amostra de tumor. Este biomarcador é denominado carga de mutação ou carga mutacional tumoral (TMB). Supõe-se que os tumores altamente mutantes são mais propensos a abrigar neoantígenos direcionados por células imunes ativadas. Essa métrica, possibilitada por avanços recentes nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS), notadamente sequenciamento de exoma total (WES) e sequenciamento de RNA (RNA-seq), demonstrou, em vários tipos de tumor, correlacionar-se com a resposta do paciente a ICB. De fato, o TMB foi correlacionado com benefícios clínicos da terapia anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em vários tipos de tumor, incluindo melanoma maligno (Snyder et al., 2014; Van Allen et al., 2015) com um limite de mais de 100 variantes não sinônimas de nucleotídeo único (nsSNV) por exoma, cânceres de pulmão de células não pequenas (NSCLC) (Rizvi et al., 2015) com um limite definido como superior a 178 nsSNVs por exoma e vários reparos de DNA deficientes tumores (Howitt et al., 2015; Le et al., 2015, 2017). Um estudo recente confirmou prospectivamente que a PFS entre pacientes com uma alta carga mutacional tumoral foi significativamente maior com nivolumab mais ipilimumab do que com quimioterapia em NSCLC (Hellmann et al., 2018). No geral, sugere-se uma ligação direta entre a deficiência de reparo do DNA, o cenário mutacional, a carga prevista de neoantígenos e a atividade clínica do ICB.

   TMB foi definido como o número de mutações somáticas, codificantes, de substituição de base e indel por megabase do genoma examinado. Todas as substituições de bases e indels na região de codificação dos genes alvo. Foi demonstrado que o TMB calculado usando o ensaio do painel de genes do câncer (CGP) concorda bem com as medidas do exoma inteiro da carga de mutação (Chalmers et al., 2017). Isso indica que o CGP, visando toda a região de codificação de várias centenas de genes, cobre tamanho genômico suficiente para avaliar com precisão a carga mutacional do WES. Verificou-se que a filtragem de alterações germinativas e variantes raras foi importante para obter medições precisas de TMB, e isso será especialmente importante em pacientes de origens étnicas não bem representadas em conjuntos de dados de sequenciamento. Esses achados indicam que o CGP é uma ferramenta precisa, econômica e clinicamente disponível para medir TMB. Os resultados da análise de amostragem reduzida mostram que a variação na medição devido à amostragem ao sequenciar 1,1 Mb é aceitavelmente baixa, resultando em chamada altamente precisa de TMB em uma faixa de níveis de TMB. Essa variação de amostragem aumenta à medida que o número de megabases sequenciadas diminui, especialmente em níveis mais baixos de TMB. Embora o CGP direcionado possa ser usado para avaliar com precisão o TMB, atualmente não é adequado para a identificação de neoantígenos, que podem ocorrer em qualquer gene. No entanto, o impacto terapêutico do TMB também foi determinado com um CGP direcionado pelo ensaio FoundationOne CDx (Hellmann et al., 2018).

   A falha na avaliação do TMB pode ocorrer em diferentes etapas do processo analítico. Pode ser na aquisição da amostra com baixo nível de DNA (5-10%). O processamento NGS dependendo do método pode levar a uma falha de processo em torno de 2-3%. E, finalmente, a curadoria bioinformática levará a 3-5% de falha. Ao final, o TMB será indeterminado com taxa de atrito de 15% das amostras (comunicação pessoal da Fondation Medicine).

   A implementação da avaliação da carga mutacional do tumor em uma perspectiva nacional é um desafio e grandes esforços devem ser feitos. Qualquer que seja o método, WES ou grande CGP, as medições de TMB mudarão a escala do sequenciamento de genes nas plataformas moleculares.

   É importante que as plataformas onde será implementada a medição da carga mutacional do tumor possam calibrar seu CGP e compará-lo a uma referência padrão para a medição de TMB. Além disso, com a quantidade limitada de DNA, o método implementado precisa produzir resultados confiáveis ​​para a maioria das amostras. As plataformas também precisam implantar seus processos de bancadas úmidas e seu pipeline de bioinformática para poder produzir o TMB em um tempo de resposta compatível com o gerenciamento de pacientes clínicos.

2. Descrição da população de participantes do estudo e justificativa para a escolha dos participantes

   Como mencionado acima, o TMB parece ser um marcador importante para a eficácia do ICB. Portanto, é importante implementar a medição TMB em nível nacional para garantir a igualdade de acesso ao ICB.

   O Instituto Nacional do Câncer da França (INCa) tem plataformas moleculares marcadas que se encarregam dos diferentes testes moleculares que devem estabelecer seus processos para poder enfrentar este novo teste. Este estudo destina-se a testar diferentes métodos CGP para avaliar a carga mutacional do tumor em cânceres de pulmão, a fim de comparar os diferentes métodos e identificar as desvantagens e falhas dos diferentes métodos. Os resultados deste estudo devem permitir estimar as necessidades para a implementação do TMB em nível nacional, recomendar painéis de genes de câncer, propor pipelines de bioinformática validados e, finalmente, recomendar processos pré-analíticos para reduzir a taxa de falha dos testes.

   Para tanto, este estudo determinará o TMB em pacientes com câncer de pulmão. Serão recrutados 200 pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e virgens de tratamento.

   Três coortes serão recrutadas:

   • 100 pacientes serão incluídos sem ressecção e determinaremos o TMB no espécime da biópsia

   • 100 pacientes serão incluídos após a ressecção cirúrgica de seu tumor e determinaremos o TMB no espécime ressecado

     • Dentro desta coorte, o TMB será avaliado tanto no espécime de biópsia quanto no espécime ressecado para 20 pacientes. 200 pacientes serão inscritos para realizar 220 análises de TMB.

   Os sites participantes são grandes plataformas que foram selecionadas com base em sua capacidade de implementação de novos testes e que possuem todas as facilidades para a realização da pesquisa descrita. Os pacientes incluídos neste estudo corresponderão àqueles que receberão inibidores de checkpoint imunológico durante o curso de sua doença. Este estudo é um estudo não intervencional, pois não modificará o atendimento clínico dos pacientes. A amostragem de tecido será feita durante o procedimento clínico necessário para o atendimento ao paciente. O estudo será proposto aos pacientes após a verificação de que os tecidos foram coletados de forma compatível com o presente estudo. Apenas material tumoral e nenhum DNA germinativo será coletado.

   Os pacientes selecionados estarão próximos daqueles que recebem ICB e a população-alvo será enriquecida com pacientes que foram ressecados cirurgicamente, a fim de poder ter tecidos suficientes para comparar nessas amostras diferentes métodos de avaliação de TMB e também comparar pré-cirúrgicos biópsias e peças cirúrgicas.

3. Descrição do elemento ou elementos sob investigação

Elementos sob investigação são o TMB de pacientes com NSCLC. A taxa de atrito (número de casos sem resultado) na estimativa do TMB será avaliada. O padrão ouro para a determinação do TMB é o WES, pois abrange todas as regiões de codificação. Vários outros métodos de painel de genes de câncer (CGP) foram descritos com base no sequenciamento de painéis de genes de câncer. O CGP incluído neste estudo será o painel da Illumina (TS500), Thermofisher (Oncomine Tumor Mutation Load Assay), painel caseiro com tecnologia Agilent (Dedicated XT HS) e Foundation medicine F1 CDx. É reconhecido que o tamanho dos painéis de genes do câncer deve ser próximo a 1Mb para poder medir de forma confiável o TMB em diferentes tipos de câncer.

Diferentes métodos de medição de TMB serão comparados nesta série em NSCLC para validar diferentes CGP disponíveis no mercado ou nas diferentes plataformas do INCa. A modelagem de bioinformática tentará correlacionar os resultados do TMB do WES e do CGP. Para tanto, com base nos resultados da carga mutacional calculados a partir dos resultados do WES, os resultados da carga mutacional serão extrapolados com base em uma seleção aleatória de 1000 genes repetidos 1000 vezes. A média do coeficiente de correlação (R2) entre a carga mutacional do tumor calculada por todo o sequenciamento do exoma e pelos diferentes painéis de genes aleatórios é de 0,88 IQR [0,84-0,91] mostrando que a seleção de genes para estimar o TMB deve ser avaliada criteriosamente antes de ser utilizada na prática clínica (resultados não publicados). O material que será coletado durante o estudo permitirá determinar o desempenho do CGP implementado nas plataformas de biologia molecular.