Compreensão dos Mecanismos de Degeneração Sináptica Subjacentes aos Sintomas Clínicos em Doentes com MDs e NDs.

Este estudo irá:

1. realizar sequenciação de RNA de sinapses pós-morte do córtex pré-frontal de doentes com esquizofrenia ou demência frontotemporal e controlos não afectados. Os dados serão combinados com dados de sequenciação de RNA já disponíveis de clones de iPSC estabelecidos de doentes com esquizofrenia ou demência frontotemporal variante comportamental e controlos não afectados. As amostras pós-morte de demência frontotemporal já foram caracterizadas em termos de patologia do córtex frontal num estudo anterior e dados de sequenciação de RNA de homogenatos estão disponíveis para comparação. O córtex pré-frontal tem sido implicado como uma região central afectada em DM e DN, tornando esta a região perfeita para determinar os condutores moleculares comuns da disfunção sináptica. A análise de vias do conjunto de dados de sequenciação de RNA será realizada para identificar vias biológicas ou genes individuais que estão desregulados nas amostras pós-morte e linhas de iPSC de cada condição. Um total de 3 genes que convergem entre os conjuntos de dados pós-morte e iPSC serão seleccionados para edição genética. Cada gene será reparado por CRISPR/Cas9 numa linha parental seleccionada de esquizofrenia e numa linha parental seleccionada de demência frontotemporal. O impacto das alterações transcricionais induzidas nos fenótipos morfológicos funcionais e sinápticos em culturas neuronais de cada linha editada geneticamente será comparado com a respectiva linha parental e com linhas de 3 controlos saudáveis. Espera-se um resgate dos fenótipos da doença de modo que a linha editada reparada mostre actividade e morfologia sináptica comparáveis às linhas de controlo saudáveis e distintas da linha parental não editada. Todas as experiências incluirão 3 réplicas biológicas, elevando o número total de análises para 420. O estudo também determinará o papel da microglia nos défices neuronais em neurónios derivados de iPSC dos 20 clones disponíveis de doentes com esquizofrenia ou demência frontotemporal variante comportamental, comparando a actividade electrofisiológica e a morfologia sináptica em culturas de neurónios derivados de iPSC sozinhos com as observadas em neurónios derivados de iPSC co-cultivados com microglia derivada de iPSC diferenciada dos mesmos clones.
2. comparar a composição molecular das sinapses pós-morte do córtex pré-frontal em 3 DM (perturbação depressiva major, perturbação bipolar e esquizofrenia) e identificar proteínas diferencialmente expressas e redes proteicas disfuncionais através de análises de vias. Para determinar os efeitos potenciais de fármacos psicotrópicos nos proteomas sinápticos, o estudo irá quantificar as concentrações de >200 fármacos psicoactivos e metabolitos em amostras pós-morte de sangue e cerebelo dos mesmos dadores e determinar a correlação com as proteínas diferencialmente expressas. Embora as análises sanguíneas forneçam informações sobre fármacos presentes no momento da morte, os dados toxicológicos no tecido cerebral, que acumula fármacos durante semanas ou mesmo meses após a última toma, servem como um melhor indicador da adesão dos sujeitos aos tratamentos. Grupos maiores que 15 sujeitos são recomendados para estudos proteómicos como este. Cada sujeito foi emparelhado com um sujeito controlo, correspondendo sexo, idade e intervalo pós-morte e sem evidência de condições psiquiátricas ou neurológicas, de acordo com os seus registos médicos.
3. quantificar e comparar a perda sináptica em regiões cerebrais que demonstraram estar associadas a volumes reduzidos em doentes com DM e DN pós-morte. Especificamente, o estudo irá comparar a densidade sináptica no córtex pré-frontal, hipocampo e estriado de doentes com perturbação depressiva major, perturbação bipolar, esquizofrenia, doença de Alzheimer, demência frontotemporal com controlos não afectados emparelhados por idade e sexo.