Utveckling av cirkulerande tumörcells molekylär diagnostik med användning av en ny mikrofluidisk anordning

För mål 1 kommer två 5 ml förbehandlingsblod och motsvarande tumörprov att erhållas från NSCLC-patienter vid National University Health System. Provtagningen kommer att organiseras för att undvika att blodproverna blir det första provet som tas efter hudpunktion för att minimera kontaminering med hudepitelceller. För det första blodprovet kommer CTCs att isoleras och hämtas med hjälp av det NUS-utvecklade CTC-biochipset enligt tidigare beskrivna metoder.21 Från det andra blodprovet kommer CTC att isoleras, fixeras på chipet och färgas för EpCAM, CD45 och DAPI för att bedöma cellens renhet och kvantitet. DNA kommer att extraheras från de hämtade CTC:erna och tumörproverna och analyseras exon 19 deletion, L858R och T790M mutationer med digital PCR på Fluidigm Biomark enligt metoder som beskrivits tidigare.23 EGFR-mutationsstatus i blod- och tumörprover kommer sedan att jämföras med avseende på deras överensstämmelse.

För mål 2 kommer patienter med NSCLC som behandlas med gefitnib att kontaktas. Två 5 ml blodprov kommer att erhållas förbehandling (baslinje) och sedan var 4:e veckas behandling (en cykel av gefitinib) från NSCLC-patienter vid National University Health System.

CTC kommer också att erhållas och analyseras från patienter på ett annat protokoll som får gefitinib/hydroxiklorokin. (B/08/196. En fas II med en ledning i fas I-studie för att undersöka tolerabiliteten, säkerhetsprofilen och effekten av Hydroxychloroquine och Gefitinib vid avancerad icke-småcellig lungcancer.) I denna studie samlas CTC redan in. Därför avser utredarna att använda prover från B/08/196 för CTC-analys med CTC-biochipplattformen.

För varje tidpunkt kommer CTCs att isoleras, hämtas och analyseras för EGFR-mutationsstatus enligt beskrivningen ovan. Kliniskt svar kommer att bestämmas med hjälp av RECIST-kriterierna.34 Samband mellan mängder av EGFR-mutationstyp före behandling och bästa kliniska svar kommer att bedömas med Fishers exakta test. Sambandet mellan trender i kvantiteter av EGFR-mutationstyp och tumörstorlek över alla behandlingscykler kommer att bedömas genom observation som utförts i studien av Maheswaran et al.9

Utredarna planerar att analysera 30 patienter under ett år för båda syftena med denna studie. Vissa fall kommer att ha relevanta prover (serieblodprover och motsvarande tumör) för båda syftena. Urvalsstorleken är baserad på den i studien av Maheshwaran et al.9 och även den sannolika volymen av lämpliga försökspersoner under 1 år vid NUHS. Relevanta data för uppskattning av urvalsstorlek saknas annars. I synnerhet saknas frekvensen av T790M-mutationer i en relevant patientpopulation, vilket visar på bristen på adekvata analyssystem för dess bedömning, såsom det som föreslås i denna studie.