Entwicklung der molekularen Diagnostik zirkulierender Tumorzellen mithilfe eines neuartigen mikrofluidischen Geräts

Für Ziel 1 werden zwei 5-ml-Vorbehandlungsblut- und entsprechende Tumorproben von NSCLC-Patienten im National University Health System entnommen. Die Probenahme wird so organisiert, dass die Blutprobe nicht als erste Probe nach der Hautpunktion entnommen wird, um eine Kontamination mit Hautepithelzellen zu minimieren. Für die erste Blutprobe werden CTCs isoliert und mithilfe des von NUS entwickelten CTC-Biochips gemäß den zuvor beschriebenen Methoden entnommen.21 Aus der zweiten Blutprobe werden CTCs isoliert, auf dem Chip fixiert und auf EpCAM, CD45 und DAPI gefärbt, um die Reinheit und Menge der Zellen zu beurteilen. DNA wird aus den entnommenen CTCs und Tumorproben extrahiert und Exon-19-Deletion sowie L858R- und T790M-Mutationen durch digitale PCR auf dem Fluidigm Biomark gemäß den zuvor beschriebenen Methoden analysiert.23 Anschließend wird der EGFR-Mutationsstatus in Blut- und Tumorproben auf ihre Übereinstimmung hin verglichen.

Für Ziel 2 werden Patienten mit NSCLC angesprochen, die mit Gefitnib behandelt werden. Zwei 5-ml-Blutproben werden vor der Behandlung (Grundlinie) und dann alle 4 Behandlungswochen (ein Gefitinib-Zyklus) von NSCLC-Patienten im National University Health System entnommen.

CTCs werden auch von Patienten mit einem anderen Protokoll, die Gefitinib/Hydroxychloroquin erhalten, ermittelt und analysiert. (B/08/196. Eine Phase-II-Studie mit Vorreiter in Phase I zur Untersuchung der Verträglichkeit, des Sicherheitsprofils und der Wirksamkeit von Hydroxychloroquin und Gefitinib bei fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.) In dieser Studie werden bereits CTCs erhoben. Daher beabsichtigen die Forscher, Proben von B/08/196 für die CTC-Analyse mithilfe der CTC-Biochip-Plattform zu verwenden.

Für jeden Zeitpunkt werden CTCs isoliert, abgerufen und wie oben beschrieben auf den EGFR-Mutationsstatus analysiert. Das klinische Ansprechen wird anhand der RECIST-Kriterien bestimmt.34 Zusammenhänge zwischen den Mengen der EGFR-Mutationstypen vor der Behandlung und dem besten klinischen Ansprechen werden durch den genauen Fisher-Test beurteilt. Der Zusammenhang zwischen Trends in der Menge der EGFR-Mutationstypen und der Tumorgröße über alle Behandlungszyklen hinweg wird durch Beobachtung beurteilt, wie sie in der Studie von Maheswaran et al.9 durchgeführt wurde

Die Forscher planen, 30 Patienten über ein Jahr hinweg für beide Ziele dieser Studie zu analysieren. In einigen Fällen werden für beide Zwecke relevante Proben (Serienblutproben und entsprechende Tumorproben) vorliegen. Die Stichprobengröße basiert auf der der Studie von Maheshwaran et al.9 und auch auf der wahrscheinlichen Anzahl geeigneter Probanden während eines Jahres an der NUHS. Ansonsten fehlen relevante Daten zur Stichprobengrößenschätzung. Insbesondere fehlt die Häufigkeit von T790M-Mutationen in einer relevanten Patientenpopulation, was das Fehlen geeigneter analytischer Systeme für deren Beurteilung, wie etwa dem in dieser Studie vorgeschlagenen, verdeutlicht.