Vývoj molekulární diagnostiky cirkulujících nádorových buněk pomocí nového mikrofluidního zařízení

Pro Cíl 1 budou od pacientů s NSCLC v National University Health System získány dva 5ml vzorky krve před léčbou a odpovídající vzorky nádoru. Odběr vzorků bude organizován tak, aby krevní vzorky nebyly prvním vzorkem odebraným po punkci kůže, aby se minimalizovala kontaminace kožními epiteliálními buňkami. Pro první vzorek krve budou CTC izolovány a získány pomocí biočipu CTC vyvinutého NUS podle metod popsaných výše.21 Z druhého vzorku krve budou izolovány CTC, fixovány na čip a obarveny na EpCAM, CD45 a DAPI, aby se vyhodnotila čistota a množství buněk. DNA bude extrahována ze získaných CTC a vzorků nádoru a analyzována delece exonu 19, mutace L858R a T790M digitální PCR na Fluidigm Biomark podle metod popsaných výše.23 Stav mutace EGFR ve vzorcích krve a nádoru bude poté porovnán z hlediska jejich shody.

Pro Cíl 2 budou osloveni pacienti s NSCLC léčeni gefitnibem. Dva 5ml vzorky krve budou odebrány před léčbou (základní hodnota) a poté každé 4 týdny léčby (jeden cyklus gefitinibu) od pacientů s NSCLC v National University Health System.

CTC budou také získány a analyzovány od pacientů na jiném protokolu, kteří užívají gefitinib/hydroxychlorochin. (B/08/196. Fáze II s úvodní studií fáze I, která zkoumá snášenlivost, bezpečnostní profil a účinnost hydroxychlorochinu a gefitinibu u pokročilého nemalobuněčného karcinomu plic.) V této studii se již CTC shromažďují. Vyšetřovatelé proto hodlají použít vzorky z B/08/196 pro analýzu CTC pomocí platformy biočipů CTC.

Pro každý časový bod budou CTC izolovány, získány a analyzovány na stav mutace EGFR, jak je popsáno výše. Klinická odpověď bude stanovena pomocí kritérií RECIST.34 Asociace mezi množstvím typu mutace EGFR před léčbou a nejlepší klinickou odpovědí bude hodnocena Fisherovým exaktním testem. Asociace mezi trendy v množství typu mutace EGFR a velikostí nádoru ve všech léčebných cyklech bude hodnocena pozorováním, jak bylo provedeno ve studii Maheswarana et al.9

Výzkumníci plánují analyzovat 30 pacientů během jednoho roku pro oba cíle této studie. Některé případy budou mít relevantní vzorky (sériové vzorky krve a odpovídající nádor) pro oba cíle. Velikost vzorku je založena na studii Maheshwarana et al.9 a také na pravděpodobném objemu vhodných subjektů během 1 roku na NUHS. Relevantní data pro odhad velikosti vzorku jinak chybí. Chybí zejména frekvence mutací T790M v relevantní populaci pacientů, což poukazuje na nedostatek adekvátních analytických systémů pro její hodnocení, jako je systém navržený v této studii.