Desarrollo de diagnóstico molecular de células tumorales circulantes utilizando un nuevo dispositivo microfluídico

Para el objetivo 1, se obtendrán dos muestras de sangre de pretratamiento de 5 ml y muestras de tumor correspondientes de pacientes con NSCLC en el Sistema de Salud de la Universidad Nacional. El muestreo se organizará para evitar que las muestras de sangre sean la primera muestra tomada después de la punción de la piel para minimizar la contaminación con células epiteliales de la piel. Para la primera muestra de sangre, las CTC se aislarán y recuperarán utilizando el biochip CTC desarrollado por NUS de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.21 A partir de la segunda muestra de sangre, se aislarán las CTC, se fijarán en el chip y se teñirán con EpCAM, CD45 y DAPI para evaluar la pureza y la cantidad de células. El ADN se extraerá de las CTC recuperadas y las muestras tumorales, y se analizarán la deleción del exón 19, las mutaciones L858R y T790M mediante PCR digital en Fluidigm Biomark de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.23 A continuación, se comparará el estado de mutación de EGFR en muestras de sangre y tumor para determinar su concordancia.

Para el Objetivo 2, se abordará a los pacientes con NSCLC tratados con gefitnib. Se obtendrán dos muestras de sangre de 5 ml antes del tratamiento (línea de base) y luego cada 4 semanas de tratamiento (un ciclo de gefitinib) de pacientes con NSCLC en el Sistema Nacional de Salud de la Universidad.

También se obtendrán y analizarán CTC de pacientes con otro protocolo que reciben gefitinib/hidroxicloroquina. (B/08/196. Un estudio de fase II con una ventaja en la fase I para examinar la tolerabilidad, el perfil de seguridad y la eficacia de la hidroxicloroquina y el gefitinib en el cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado). En este estudio, los CTC ya se están recolectando. Por lo tanto, los investigadores tienen la intención de usar muestras de B/08/196 para el análisis de CTC utilizando la plataforma de biochip CTC.

Para cada punto de tiempo, las CTC se aislarán, recuperarán y analizarán para determinar el estado de mutación de EGFR como se describe anteriormente. La respuesta clínica se determinará utilizando los criterios RECIST34. Las asociaciones entre las cantidades de tipo de mutación de EGFR previas al tratamiento y la mejor respuesta clínica se evaluarán mediante la prueba exacta de Fisher. La asociación entre las tendencias en las cantidades del tipo de mutación de EGFR y el tamaño del tumor durante todos los ciclos de tratamiento se evaluará mediante la observación realizada en el estudio de Maheswaran et al.9

Los investigadores planean analizar 30 pacientes durante un año para ambos objetivos de este estudio. Algunos casos tendrán muestras relevantes (muestras seriadas de sangre y del tumor correspondiente) para ambos fines. El tamaño de la muestra se basa en el del estudio de Maheshwaran et al.9 y también en el volumen probable de sujetos adecuados durante 1 año en NUHS. Por lo demás, faltan datos pertinentes para la estimación del tamaño de la muestra. En particular, se desconoce la frecuencia de las mutaciones T790M en una población de pacientes relevante, lo que pone de relieve la falta de sistemas analíticos adecuados para su evaluación como el propuesto en este estudio.