Desenvolvimento de Diagnóstico Molecular de Células Tumorais Circulantes Usando um Novo Dispositivo Microfluídico

Para o Objetivo 1, serão obtidas duas amostras de sangue pré-tratamento de 5 ml e amostras de tumor correspondentes de pacientes com NSCLC no National University Health System. A amostragem será organizada para evitar que as amostras de sangue sejam a primeira coleta após a punção da pele para minimizar a contaminação com células epiteliais da pele. Para a primeira amostra de sangue, as CTCs serão isoladas e recuperadas usando o biochip CTC desenvolvido pela NUS de acordo com os métodos descritos anteriormente.21 Da segunda amostra de sangue, as CTCs serão isoladas, fixadas no chip e coradas para EpCAM, CD45 e DAPI para avaliar a pureza e a quantidade de células. O DNA será extraído das CTCs e amostras tumorais recuperadas e analisado a deleção do exon 19, mutações L858R e T790M por PCR digital no Fluidigm Biomark de acordo com os métodos descritos anteriormente.23 O status da mutação EGFR em amostras de sangue e tumor será então comparado quanto à sua concordância.

Para o Objetivo 2, serão abordados pacientes com NSCLC em tratamento com gefitnib. Duas amostras de sangue de 5 ml serão obtidas antes do tratamento (linha de base) e depois a cada 4 semanas de tratamento (um ciclo de gefitinibe) de pacientes com NSCLC no National University Health System.

CTCs também serão obtidas e analisadas de pacientes em outro protocolo recebendo gefitinibe/hidroxicloroquina. (B/08/196. Um estudo de fase II com liderança no estudo de fase I para examinar a tolerabilidade, o perfil de segurança e a eficácia da hidroxicloroquina e do gefitinibe no câncer avançado de pulmão de células não pequenas.) Neste estudo, as CTCs já estão sendo coletadas. Assim, os investigadores pretendem usar amostras de B/08/196 para análise CTC usando a plataforma CTC biochip.

Para cada ponto de tempo, as CTCs serão isoladas, recuperadas e analisadas quanto ao status de mutação do EGFR, conforme descrito acima. A resposta clínica será determinada usando os critérios RECIST.34 As associações entre as quantidades do tipo de mutação EGFR pré-tratamento e a melhor resposta clínica serão avaliadas pelo teste exato de Fisher. A associação entre as tendências nas quantidades do tipo de mutação do EGFR e o tamanho do tumor ao longo de todos os ciclos de tratamento será avaliada por observação, conforme realizado no estudo de Maheswaran et al.9

Os investigadores planejam analisar 30 pacientes ao longo de um ano para ambos os objetivos deste estudo. Alguns casos terão amostras relevantes (amostras seriadas de sangue e tumor correspondente) para ambos os objetivos. O tamanho da amostra é baseado no estudo de Maheshwaran et al.9 e também no volume provável de sujeitos adequados durante 1 ano no NUHS. Faltam dados relevantes para estimativa do tamanho da amostra. Em particular, falta a frequência das mutações T790M em uma população de pacientes relevante, destacando a falta de sistemas analíticos adequados para sua avaliação, como o proposto neste estudo.