Sviluppo della diagnostica molecolare delle cellule tumorali circolanti utilizzando un nuovo dispositivo microfluidico

Per l'obiettivo 1, verranno prelevati due campioni di sangue pre-trattamento da 5 ml e i corrispondenti campioni tumorali da pazienti con NSCLC presso il Sistema Sanitario Universitario Nazionale. Il campionamento sarà organizzato per evitare che i campioni di sangue siano il primo campione prelevato dopo la puntura della pelle per ridurre al minimo la contaminazione con le cellule epiteliali della pelle. Per il primo campione di sangue, le CTC saranno isolate e recuperate utilizzando il bio-chip CTC sviluppato da NUS secondo i metodi descritti in precedenza.21 Dal secondo campione di sangue, le CTC saranno isolate, fissate sul chip e colorate per EpCAM, CD45 e DAPI per valutare la purezza e la quantità delle cellule. Il DNA sarà estratto dalle CTC recuperate e dai campioni tumorali e analizzato la delezione dell'esone 19, le mutazioni L858R e T790M mediante PCR digitale sul Fluidigm Biomark secondo i metodi descritti in precedenza.23 Lo stato della mutazione dell'EGFR nei campioni di sangue e tumore verrà quindi confrontato per la loro concordanza.

Per l'obiettivo 2, verranno contattati i pazienti con NSCLC in trattamento con gefitnib. Verranno prelevati due campioni di sangue da 5 ml prima del trattamento (basale) e poi ogni 4 settimane di trattamento (un ciclo di gefitinib) da pazienti con NSCLC presso il Sistema Sanitario Universitario Nazionale.

Le CTC saranno ottenute e analizzate anche da pazienti con un altro protocollo che ricevono gefitinib/idrossiclorochina. (B/08/196. Uno studio di fase II con uno studio di fase I per esaminare la tollerabilità, il profilo di sicurezza e l'efficacia dell'idrossiclorochina e del gefitinib nel carcinoma polmonare non a piccole cellule avanzato.) In questo studio, i CTC sono già stati raccolti. Quindi gli investigatori intendono utilizzare campioni da B/08/196 per l'analisi CTC utilizzando la piattaforma biochip CTC.

Per ogni punto temporale, le CTC saranno isolate, recuperate e analizzate per lo stato di mutazione dell'EGFR come descritto sopra. La risposta clinica sarà determinata utilizzando i criteri RECIST.34 Le associazioni tra le quantità del tipo di mutazione dell'EGFR pre-trattamento e la migliore risposta clinica saranno valutate mediante il test esatto di Fisher. L'associazione tra le tendenze nelle quantità del tipo di mutazione dell'EGFR e le dimensioni del tumore durante tutti i cicli di trattamento sarà valutata mediante osservazione come eseguita nello studio di Maheswaran et al.9

I ricercatori hanno in programma di analizzare 30 pazienti in un anno per entrambi gli obiettivi di questo studio. Alcuni casi avranno campioni rilevanti (prelievi di sangue seriali e tumore corrispondente) per entrambi gli obiettivi. La dimensione del campione si basa su quella dello studio di Maheshwaran et al.9 e anche sul probabile volume di soggetti idonei durante 1 anno al NUHS. Per il resto mancano dati rilevanti per la stima della dimensione del campione. In particolare, manca la frequenza delle mutazioni T790M in una popolazione di pazienti rilevante, evidenziando la mancanza di adeguati sistemi analitici per la sua valutazione come quello proposto in questo studio.