一项确定类固醇耐药分子标记的开放标签研究 (MERK2)

第 1 次访问：基线评估和鼻内窥镜检查

此次访视时，每位受试者将签署知情同意书，确认受试者的研究资格，获取病史，对受试者进行体格检查和鼻内窥镜检查。 将对所有有生育能力的女性进行尿液妊娠试验。 NP 大小将使用 NP 评分系统记录（见下文）。

只有在过去 3 年内未进行过过敏性皮肤测试才会进行。

第 2 次就诊：治疗前鼻息肉 (NP) 活检

在这次访问中，每个受试者都将接受治疗前的 NP 活检。 活组织检查将由 Eric Holbrook 博士在 Massachusetts Eye & Ear Infirmary 获得，该医院毗邻 MGH。

第 3 次访问：开始使用 MFNS 进行治疗

在这次访问中，每位受试者都将进行鼻窥镜检查，以确认 NP 活检没有残留出血。 然后，将向受试者提供 4 周的 MFNS (Nasonex®) 供应，并指导其进行 2 次喷雾/鼻孔 BID。 将向受试者提供 NP 症状日记，并指示其每天记录 NP 症状，持续 4 周。

每个受试者将被分配一个唯一的编号（筛选或基线编号）用于识别目的。 在任何情况下都不会为一名患者分配多个分配编号。 Nasonex 瓶将从 MGH 研究药房分发。

第 4 次访问：治疗中 NP 活检

在这次访问中，每个受试者都将接受治疗中的 NP 活检。 活组织检查将由 Eric Holbrook 博士在 Massachusetts Eye & Ear Infirmary 获得，该医院毗邻 MGH。 受试者将被要求在活组织检查后 48 小时内停止 Nasonex 治疗。

第 5 次访问：活检后检查 在这次访问中，每位受试者都将进行鼻窥器检查，以确认 NP 活检没有残留出血。 如果出血停止，受试者将恢复 Nasonex 治疗。

第 5 6 次访问：最终访问和鼻内窥镜检查

在这次访问中，每个受试者将归还他们使用过和未使用过的 Nasonex 瓶并提交他们的 NP 症状日记并进行鼻内窥镜检查。 NP 大小将使用 NP 评分系统记录（见下文）。 受试者还将完成对 MFNS 对其 NP 症状疗效的全面评估。

实验步骤：

活检前外植体培养：我们将从每位患者的类固醇治疗前获得用于体外外植体培养的 NP 活检。 我们将在 MF 中以 0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M 培养外植体，并根据细胞凋亡的诱导（激活的 caspase-3 表达）分析炎症细胞浸润和类固醇敏感性。炎症细胞亚群、α-平滑肌细胞肌动蛋白+肌成纤维细胞和上皮细胞。 每个条件将一式两份执行，以便可以处理一个样本用于 IHC，另一个样本用于微阵列。

外植体培养：NP 外植体将使用平底组织培养板在 37oC 的基本必需培养基中培养 24 小时。 培养 24 小时后，每种情况将处理 1 个外植体用于 IHC，1 个用于微阵列。 我们还将根据 IHC 和微阵列的数据，保存每种外植体条件下的培养物上清液，以确认蛋白质生产的重要差异。

免疫组织化学 (IHC) 和共聚焦激光免疫荧光显微镜 (CLM)：将通过免疫荧光共聚焦激光显微镜 (IF-CLM) 分析 MFNS 治疗前后 SS-NP 和 SR-NP 患者的冷冻 NP 样本的 T 淋巴细胞（CD3 和 CD4 )、MBP+ 嗜酸性粒细胞、α-平滑肌肌动蛋白（活化肌成纤维细胞的标志物，单克隆抗体，R & D Systems, Inc.）和裂解的 caspase-3（多克隆抗体，CST，Beverly，MA）。 每种类型的炎症细胞和每种类型的裂解的 caspase-3 阳性和阴性细胞的数量将由两名对治疗和收集顺序不知情的观察者进行计数。 与我们之前的研究一样，将使用染色范围和强度的半定量分级对 PCNA（上皮细胞增殖的标志物）和裂解的 caspase-3 进行类似的上皮染色定量。 免疫染色的强度和分布将根据以下半定量分级量表进行量化：0 = 无染色，1 = 轻度弥漫性或中度斑片状染色； 2 = 中度弥散染色； 3 = 由 2 名独立观察者在上皮细胞、间质和腺体中进行强烈的弥漫性染色。

组织学类固醇敏感和类固醇抗性表型指定：将 NP 受试者指定为组织学“类固醇敏感”或“类固醇抗性”将基于 MFNS 治疗前和治疗后 1 周的以下措施：

1. NP 炎症中 NP 嗜酸性粒细胞减少的程度改善，
2. 嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞和上皮细胞凋亡诱导的程度，
3. 基于微阵列分析的炎症基因表达抑制程度。

受试者将按对治疗最敏感到最不敏感的顺序排列。 线性回归将用于检查这些独立连续变量之间的相关性。

微阵列分析：微阵列分析将用于评估全局基因 mRNA 表达，并捕获之前获得的“类固醇敏感”(SS-NP) 和“类固醇抗性”SR-NP 活检中促凋亡和抗凋亡基因表达的信息 1鼻内糠酸莫米松 (MFNS) 治疗后一周。 微阵列的 RNA 分离是使用 Arcturus picopure RNA 分离系统完成的。 塑料 LCM 收集盖在 25 微升试剂盒中含有 GITC 的提取缓冲液中于 42oC 孵育 30 分钟，短暂离心以收集提取溶液，然后冷冻于 -80oC。 在 picopure RNA 柱上纯化之前，将样品解冻并合并，并通过柱上的无 RNAse DNAse（Qiagen，Hilden，GmbH）消化去除基因组 DNA。 来自每根柱子的总细胞 RNA 在 11 微升洗脱缓冲液中洗脱并用于制备 RNA-Seq 文库，或转化为 cDNA-用于 QRTPCR 测定，使用 20 微升总反应体积通过标准上标 III（Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德) 协议。 我们还有来自之前研究中获得的 8 个健康对照中鼻甲的微阵列数据，这些数据将用于比较基因表达与鼻息肉。

使用 ArrayPure™ 纳米级 RNA 纯化试剂盒（EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI）从每位患者的一个 NP 活检中纯化 RNA，其中包括 ScriptGuard™ RNase 抑制剂以保持纯化 RNA 的完整性。 使用 RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA) 检查纯化的 RNA 质量。 灵敏度下限为 200 pg/ml，这使我们能够验证从大约 1250 个细胞中提取的 RNA 的质量。

QRTPCR：通过 RNA 表达谱差异表达的基因将通过定量实时 RT-PCR 从每个组织隔室中分离的小份纯化 RNA 样品中进一步研究。 将使用 Multiplex MX3000P 定量 RT-PCR 系统（Stratagene，La Jolla，CA）进行 RT-PCR。 基线基因表达将通过 QRTPCR 相对于 GAPDH 使用 delta-delta Ct (2-ΔΔ) 方法进行量化。 将根据 primerbank 软件 (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) 选择正向和反向引物。 为了确认组织内的基因表达，我们将像以前的研究一样使用免疫组织化学。