스테로이드 내성의 분자 마커를 식별하기 위한 공개 라벨 연구 (MERK2)

방문 1: 기준선 평가 및 비강 내시경 검사

이 방문에서 각 피험자는 정보에 입각한 동의서에 서명하고 피험자의 연구 적격성을 확인하고 병력을 확보하고 피험자는 신체 검사 및 비강 내시경 검사를 받게 됩니다. 임신 가능성이 있는 모든 여성에게 소변 임신 검사를 실시합니다. NP 크기는 NP 점수 시스템을 사용하여 기록됩니다(아래 참조).

알레르기 피부 검사는 지난 3년 동안 수행되지 않은 경우에만 수행됩니다.

방문 2: 전처리 비용종(NP) 생검

이번 방문에서 각 피험자는 전처리 NP 생검을 받게 됩니다. 생검은 MGH에 인접한 Massachusetts Eye & Ear Infirmary의 Eric Holbrook 박사가 실시합니다.

방문 3: MFNS로 치료 시작

이 방문에서 각 피험자는 NP 생검에서 잔류 출혈이 없는지 확인하기 위해 비강 검경 검사를 받게 됩니다. 그 다음, 피험자는 4주간의 MFNS(Nasonex ®) 공급을 받고 2회 스프레이/비공 BID를 취하도록 지시받을 것입니다. 피험자에게 NP 증상 일지를 제공하고 4주 동안 매일 NP 증상을 기록하도록 지시합니다.

각 피험자에게는 식별을 위해 고유 번호(선별 또는 기준선 번호)가 지정됩니다. 어떤 경우에도 환자에게 하나 이상의 할당 번호가 지정되지 않습니다. Nasonex 병은 MGH Research Pharmacy에서 제공됩니다.

방문 4: 치료 중 NP 생검

이번 방문에서 각 피험자는 치료 중 NP 생검을 받게 됩니다. 생검은 MGH에 인접한 Massachusetts Eye & Ear Infirmary의 Eric Holbrook 박사가 실시합니다. 피험자는 이 생검 후 48시간 동안 Nasonex 치료를 보류하도록 요청받을 것입니다.

방문 5: 생검 후 검사 이 방문에서 각 피험자는 NP 생검에서 잔류 출혈이 없는지 확인하기 위해 비강 검경 검사를 받게 됩니다. 출혈이 멈춘 경우 대상자는 Nasonex 치료를 재개합니다.

방문 5 6: 최종 방문 및 비강 내시경 검사

이번 방문에서 각 피험자는 사용한 Nasonex 병과 사용하지 않은 병을 반환하고 NP 증상 일지를 제출하고 비강 내시경 검사를 받게 됩니다. NP 크기는 NP 점수 시스템을 사용하여 기록됩니다(아래 참조). 피험자는 또한 NP 증상에 대한 MFNS 효능의 전반적인 평가를 완료할 것입니다.

실험 절차:

사전 생검 체외 배양: 각 환자로부터 스테로이드 치료 전에 체외 체외 체외 배양을 위한 NP 생검을 얻습니다. 우리는 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M에서 MF의 외식편을 배양하고 세포 사멸 유도(활성화된 caspase-3 발현)를 기반으로 염증 세포 침윤 및 스테로이드 민감성을 분석할 것입니다. 염증 세포 하위 집합, 알파-평활근 세포 액틴+ 근섬유모세포 및 상피 세포. 각 조건은 이중으로 수행되어 하나의 샘플이 IHC용으로 처리되고 다른 하나는 마이크로어레이용으로 처리될 수 있습니다.

외식편 배양: NP 외식편은 바닥이 평평한 조직 배양 플레이트를 사용하여 37oC에서 24시간 동안 최소 필수 배지에서 배양됩니다. 배양 24시간 후, 조건당 1개의 외식편은 IHC용으로, 1개는 마이크로어레이용으로 처리됩니다. 또한 IHC 및 마이크로어레이의 데이터를 기반으로 단백질 생산의 중요한 차이를 확인하기 위해 각 외식편 조건의 배양 상청액을 저장합니다.

면역조직화학(IHC) 및 공초점 레이저 면역형광 현미경(CLM): MFNS 치료 전후 SS-NP 및 SR-NP 환자의 냉동 NP 샘플을 T 림프구(CD3 및 CD4)에 대한 면역형광 공초점 레이저 현미경(IF-CLM)으로 분석합니다. ), MBP+ 호산구, 알파 평활근 액틴(활성 근섬유아세포의 마커, 단클론, R&D Systems, Inc.) 및 절단된 카스파제-3(다클론, CST, Beverly, MA). 각 유형의 염증 세포 및 각 유형의 절단된 카스파아제-3 양성 및 음성 세포의 수는 치료 및 수집 순서에 대해 눈이 먼 2명의 관찰자가 계산합니다. PCNA(상피 세포 증식의 마커) 및 절단된 카스파아제-3에 대한 상피 염색의 유사한 정량화는 이전 연구에서와 같이 염색 정도 및 강도의 반정량적 등급을 사용하여 수행될 것입니다. 면역염색의 강도 및 분포는 다음의 반정량적 등급 척도에서 정량화될 것입니다: 0 = 염색 없음, 1 = 약한 확산 또는 중간 정도의 반점형 염색; 2 = 중간 확산 염색; 3 = 2명의 독립적인 관찰자에 의한 상피, 간질 및 땀샘에서의 강렬한 확산 염색.

조직학적 스테로이드 민감성 및 스테로이드 내성 표현형 지정: NP 대상체를 조직학적으로 "스테로이드 민감성" 또는 "스테로이드 내성"으로 지정하는 것은 MFNS로 치료 전 및 치료 1주 후 다음 측정을 기반으로 합니다.

1. NP 호산구 감소 정도 NP 염증 개선,
2. 호산구, T 림프구 및 상피 세포에서 세포 사멸 유도 정도,
3. 마이크로어레이 분석에 기반한 염증 유전자 발현 억제 정도.

피험자는 치료에 가장 민감한 것부터 가장 덜 민감한 것까지 순서대로 순위가 매겨집니다. 선형 회귀는 이러한 독립적인 연속 변수 간의 상관 관계를 조사하는 데 사용됩니다.

마이크로어레이 분석: 마이크로어레이 분석은 전체 유전자 mRNA 발현을 평가하고 이전에 얻은 "스테로이드 민감성"(SS-NP) 및 "스테로이드 내성" SR-NP 생검에서 프로- 및 안티-아폽토시스 유전자 발현에 대한 정보를 포착하는 데 사용될 것입니다. 비강내 모메타손 푸로에이트(MFNS) 치료 후 1주. 마이크로어레이를 위한 RNA 분리는 Arcturus picopure RNA 분리 시스템을 사용하여 수행됩니다. 플라스틱 LCM 수집 캡을 키트의 GITC 함유 추출 버퍼 25마이크로리터에서 30분 동안 42oC에서 배양하고, 추출된 용액을 수집하기 위해 잠시 원심분리한 다음 -80oC에서 동결합니다. 피코퓨어(picopure) RNA 컬럼에서 정제하기 전에 샘플을 해동하고 풀링하고 컬럼에서 RNAse-free DNAse(Qiagen, Hilden, GmbH) 소화를 통해 게놈 DNA를 제거합니다. 각 컬럼의 총 세포 RNA는 11마이크로리터의 용출 완충액에서 용출되고 RNA-Seq 라이브러리의 준비에 사용되거나 표준 위첨자 III(Invitrogen, Carlsbad, CA) 프로토콜. 우리는 또한 비용종에 대한 유전자 발현의 비교에 사용될 이전 연구에서 얻은 8개의 건강한 대조군 중비갑개로부터의 마이크로어레이 데이터를 가지고 있습니다.

정제된 RNA의 무결성을 유지하기 위해 ScriptGuard™ RNase Inhibitor를 포함하는 ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit(EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI)를 사용하여 환자당 하나의 NP 생검에서 RNA를 정제합니다. 정제된 RNA 품질은 RNA 나노 분석(Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 확인합니다. 하한 민감도는 200 pg/ml로 약 1250개의 세포에서 추출한 RNA의 품질을 확인할 수 있습니다.

QRTPCR: RNA 발현 프로파일링에 의해 차등적으로 발현되는 유전자는 각 조직 구획에서 정제된 RNA의 별도의 작은 샘플로부터 정량적 실시간 RT-PCR에 의해 추가로 조사될 것입니다. RT-PCR은 Multiplex MX3000P 정량적 RT-PCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 수행됩니다. 기준선 유전자 발현은 델타-델타 Ct(2-∆∆) 방법을 사용하여 GAPDH에 대한 QRTPCR에 의해 정량화됩니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 primerbank 소프트웨어(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)를 기반으로 선택됩니다. 조직 내 유전자 발현을 확인하기 위해 이전 연구에서와 같이 면역조직화학을 사용할 것입니다.