Een open-label studie om moleculaire markers van steroïderesistentie te identificeren (MERK2)

Bezoek 1: Baseline-evaluatie en nasale endoscopie

Bij dit bezoek zal elke proefpersoon een geïnformeerde toestemming ondertekenen, zal worden bevestigd dat de proefpersoon in aanmerking komt voor het onderzoek, zal een medische geschiedenis worden verkregen, zal de proefpersoon een lichamelijk onderzoek ondergaan en een nasale endoscopie ondergaan. Bij alle vrouwen die zwanger kunnen worden, wordt een urine-zwangerschapstest uitgevoerd. NP-grootte wordt geregistreerd met behulp van het NP-scoresysteem (zie hieronder).

Allergie-huidtesten worden alleen uitgevoerd als dit de afgelopen 3 jaar niet is gedaan.

Bezoek 2: Pre-treatment neuspoliepen (NP) biopsieën

Bij dit bezoek ondergaat elke proefpersoon de pre-treatment NP-biopten. De biopsieën zullen worden verkregen door Dr. Eric Holbrook in de Massachusetts Eye & Ear Infirmary, gelegen naast MGH.

Bezoek 3: Start van behandeling met MFNS

Bij dit bezoek zal elke proefpersoon een neusspeculumonderzoek ondergaan om te bevestigen dat er geen resterende bloeding uit de NP-biopten is. Vervolgens krijgt de proefpersoon een voorraad MFNS (Nasonex ®) voor 4 weken en wordt hij geïnstrueerd om 2 verstuivingen/neusgat tweemaal daags in te nemen. Proefpersonen krijgen een NP-symptoomdagboek en worden geïnstrueerd om gedurende 4 weken dagelijks NP-symptomen te noteren.

Elke proefpersoon krijgt ter identificatie een uniek nummer (screening- of baselinenummer). In geen geval krijgt een patiënt meer dan één toewijzingsnummer toegewezen. De Nasonex-flessen worden geleverd door de MGH Research Pharmacy.

Bezoek 4: NP-biopsie tijdens de behandeling

Tijdens dit bezoek ondergaat elke proefpersoon de NP-biopten tijdens de behandeling. De biopsieën zullen worden verkregen door Dr. Eric Holbrook in de Massachusetts Eye & Ear Infirmary, gelegen naast MGH. De proefpersoon zal worden gevraagd om de behandeling met Nasonex gedurende 48 uur na deze biopsie achterwege te laten.

Bezoek 5: Post-biopsie-onderzoek Bij dit bezoek zal elke proefpersoon een neusspeculumonderzoek ondergaan om te bevestigen dat er geen resterende bloeding uit de NP-biopten is. Als het bloeden is gestopt, hervat de patiënt de behandeling met Nasonex.

Bezoek 5 6: Eindbezoek en neusendoscopie

Bij dit bezoek zal elke proefpersoon zijn gebruikte en ongebruikte flessen Nasonex teruggeven en zijn NP-symptoomdagboek indienen en een nasale endoscopie ondergaan. NP-grootte wordt geregistreerd met behulp van het NP-scoresysteem (zie hieronder). Proefpersonen zullen ook een globale beoordeling van de werkzaamheid van MFNS voor hun NP-symptomen voltooien.

EXPERIMENTELE PROCEDURES:

Pre-biopten explantatieculturen: we zullen NP-biopten verkrijgen voor in vitro explantatiecultuur vóór behandeling met steroïden van elke patiënt. We zullen de explantaten kweken in MF op 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M en ontstekingscelinfiltraat en gevoeligheid voor steroïden analyseren op basis van inductie van apoptose (geactiveerde caspase-3-expressie) in inflammatoire cel subsets, alfa-gladde spiercel actine + myofibroblasten en epitheelcellen. Elke voorwaarde wordt in tweevoud uitgevoerd, zodat één monster kan worden verwerkt voor IHC en één voor microarray.

Explantaatculturen: NP-explantaten worden gedurende 24 uur bij 37oC gekweekt in minimaal essentieel medium met behulp van weefselkweekplaten met vlakke bodem. Na 24 uur in kweek wordt 1 explantaat per aandoening verwerkt voor IHC en 1 voor microarray. We zullen ook kweeksupernatant van elke explantatieconditie bewaren voor bevestiging van belangrijke verschillen in eiwitproductie, op basis van gegevens van de IHC en microarrays.

Immunohistochemie (IHC) en confocale laser immunofluorescentiemicroscopie (CLM): Bevroren NP-monsters van SS-NP- en SR-NP-patiënten voor en na MFNS-behandeling zullen worden geanalyseerd door immunofluorescentie confocale lasermicroscopie (IF-CLM) voor T-lymfocyten (CD3 en CD4 ), MBP+ eosinofielen, alfa-gladde spieractine (marker van geactiveerde myofibroblasten, monoklonaal, R & D Systems, Inc.) en gesplitst caspase-3 (polyklonaal, CST, Beverly, MA). Het aantal ontstekingscellen van elk type en gesplitste caspase-3 positieve en negatieve cellen van elk type zal worden geteld door twee waarnemers die blind zijn voor behandeling en volgorde van verzameling. Een vergelijkbare kwantificering van epitheliale kleuring voor PCNA (een marker van epitheelcelproliferatie) en gesplitste caspase-3 zal worden uitgevoerd met behulp van semi-kwantitatieve beoordeling van omvang en intensiteit van kleuring zoals in onze eerdere studies. De intensiteit en verdeling van immunokleuring zal worden gekwantificeerd op een semi-kwantitatieve beoordelingsschaal van: 0 = afwezige kleuring, 1 = milde diffuse of matige vlekkerige kleuring; 2 = matige diffuse kleuring; 3 = intense diffuse kleuring in het epitheel, stroma en klieren door 2 onafhankelijke waarnemers.

Histologische steroïde-gevoelige en steroïde-resistente fenotype-aanduiding: Aanwijzing van NP-proefpersonen als histologisch "steroïde-gevoelig" of "steroïde-resistent" zal gebaseerd zijn op de volgende maatregelen vóór en 1 week na behandeling met MFNS:

1. mate van vermindering van NP-eosinofielen verbetering van NP-ontsteking,
2. mate van inductie van apoptose in eosinofielen, T-lymfocyten en epitheelcellen,
3. mate van onderdrukking van inflammatoire genexpressie op basis van microarray-analyse.

Onderwerpen worden gerangschikt in volgorde van meest gevoelig tot minst gevoelig voor behandeling. Lineaire regressie zal worden gebruikt om correlaties tussen deze onafhankelijke continue variabelen te onderzoeken.

Microarray-analyse: microarray-analyse zal worden gebruikt om globale gen-mRNA-expressie te beoordelen en ook informatie vast te leggen over pro- en anti-apoptotische genexpressie in "steroïde-gevoelige" (SS-NP) en "steroïde-resistente" SR-NP-biopten verkregen vóór en 1 week na behandeling met intranasaal mometasonfuroaat (MFNS). RNA-isolatie voor microarray wordt gedaan met behulp van het Arcturus picopure RNA-isolatiesysteem. Plastic LCM-opvangdoppen worden 30 minuten bij 42oC geïncubeerd in 25 microliter van de GITC-bevattende extractiebuffer van de kit, kort gecentrifugeerd om de geëxtraheerde oplossing op te vangen, en vervolgens ingevroren bij -80oC. Monsters worden voorafgaand aan zuivering ontdooid en samengevoegd op picopure RNA-kolommen en genomisch DNA wordt verwijderd via RNAse-vrije DNAse (Qiagen, Hilden, GmbH) digestie op de kolommen. Totaal cellulaire RNA's van elke kolom worden geëlueerd in 11 microliter elutiebuffer en gebruikt voor bereiding van de RNA-Seq-bibliotheek, of omgezet in cDNA voor de QRTPCR-assay, met behulp van een totaal reactievolume van 20 microliter via het standaard superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) protocol. We hebben ook microarray-gegevens van 8 gezonde controle middenschelpen verkregen in een eerdere studie die zal worden gebruikt voor vergelijking van genexpressie met neuspoliepen.

RNA zal worden gezuiverd uit één NP-biopsie per patiënt met behulp van de ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit, (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) die ScriptGuard™ RNase-remmer bevat om de integriteit van gezuiverd RNA te behouden. Gezuiverde RNA-kwaliteit zal worden gecontroleerd met behulp van RNA Nano-analyse (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). De ondergrens van de gevoeligheid is 200 pg/ml, waardoor we de kwaliteit kunnen verifiëren van RNA dat is geëxtraheerd uit ongeveer 1250 cellen.

QRTPCR: Genen die differentieel tot expressie worden gebracht door RNA-expressieprofilering zullen verder worden onderzocht door middel van kwantitatieve real-time RT-PCR uit een afzonderlijk klein monster van gezuiverd RNA uit elk weefselcompartiment. RT-PCR zal worden uitgevoerd met behulp van het Multiplex MX3000P kwantitatieve RT-PCR-systeem (Stratagene, La Jolla, CA). Baseline genexpressie zal worden gekwantificeerd door QRTPCR ten opzichte van GAPDH met behulp van de delta-delta Ct (2-∆∆) methode. Forward en reverse primers worden geselecteerd op basis van primerbank-software (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Om genexpressie in weefsels te bevestigen, zullen we immunohistochemie gebruiken zoals in eerdere studies.