ステロイド耐性の分子マーカーを特定するための非盲検研究 (MERK2)

来院 1: ベースライン評価と経鼻内視鏡検査

この訪問時に、各被験者はインフォームドコンセントに署名し、被験者の研究への適格性が確認され、病歴が取得され、被験者は身体検査と鼻内視鏡検査を受けます。 尿妊娠検査は、出産の可能性のあるすべての女性に対して行われます。 NP サイズは、NP スコアリング システムを使用して記録されます (下記参照)。

アレルギー皮膚検査は、過去3年間実施されていない場合にのみ実施されます。

来院 2: 治療前の鼻ポリープ (NP) 生検

この訪問で、各被験者は治療前のNP生検を受けます。 生検は、MGH に隣接する Massachusetts Eye & Ear Infirmary の Dr. Eric Holbrook によって取得されます。

訪問 3: MFNS による治療の開始

この訪問時に、各被験者は鼻鏡検査を受けて、NP生検からの残留出血がないことを確認します。 次に、対象にＭＦＮＳ（Ｎａｓｏｎｅｘ（登録商標））を４週間供給し、ＢＩＤ／鼻孔あたり２回スプレーするように指示する。 被験者にはNP症状日誌が与えられ、NP症状を4週間毎日記録するように指示されます。

各被験者には、識別目的で一意の番号 (スクリーニング番号またはベースライン番号) が割り当てられます。 いかなる状況においても、患者に複数の割り当て番号が割り当てられることはありません。 Nasonex ボトルは、MGH Research Pharmacy から調剤されます。

訪問 4: 治療中の NP 生検

この訪問で、各被験者は治療中のNP生検を受けます。 生検は、MGH に隣接する Massachusetts Eye & Ear Infirmary の Dr. Eric Holbrook によって取得されます。 被験者は、この生検後 48 時間は Nasonex 治療を控えるよう求められます。

来院５：生検後の検査 この来院時に、各被験者は鼻鏡検査を受けて、ＮＰ生検からの残留出血がないことを確認する。 出血が止んだ場合、被験者は Nasonex 治療を再開します。

来院 5 6: 最終来院と経鼻内視鏡検査

この来院時に、各被験者は使用済みおよび未使用の Nasonex ボトルを返却し、NP 症状日記を提出し、鼻内視鏡検査を受けます。 NP サイズは、NP スコアリング システムを使用して記録されます (下記参照)。 被験者はまた、NP症状に対するMFNSの有効性の全体的な評価を完了します。

実験手順：

生検前の外植培養:各患者からステロイド治療の前に、in vitro外植培養のNP生検を取得します。 外植片を MF で 0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 M で培養し、炎症細胞浸潤とステロイド感受性をアポトーシスの誘導 (活性化カスパーゼ-3 発現) に基づいて分析します。炎症細胞サブセット、アルファ平滑筋細胞アクチン + 筋線維芽細胞および上皮細胞。 1 つのサンプルを IHC 用に、もう 1 つのサンプルをマイクロ アレイ用に処理できるように、各条件は重複して実行されます。

外植片培養: 平底組織培養プレートを使用して、NP 外植片を最小必須培地で 37oC で 24 時間培養します。 24 時間の培養後、条件ごとに 1 つの外植片を IHC 用に処理し、1 つの外植片をマイクロアレイ用に処理します。 また、IHCおよびマイクロアレイからのデータに基づいて、タンパク質産生の重要な違いを確認するために、各外植条件から培養上清を保存します。

免疫組織化学 (IHC) および共焦点レーザー免疫蛍光顕微鏡 (CLM): MFNS 治療前後の SS-NP および SR-NP 患者からの凍結 NP サンプルは、T リンパ球 (CD3 および CD4) について免疫蛍光共焦点レーザー顕微鏡 (IF-CLM) によって分析されます。 )、MBP+ 好酸球、アルファ平滑筋アクチン (活性化筋線維芽細胞のマーカー、モノクローナル、R & D Systems, Inc.)、および切断されたカスパーゼ-3 (ポリクローナル、CST、マサチューセッツ州ビバリー)。 各タイプの炎症細胞と切断された各タイプのカスパーゼ-3陽性および陰性細胞の数は、治療と収集の順序を知らされていない2人の観察者によってカウントされます。 PCNA（上皮細胞増殖のマーカー）および切断されたカスパーゼ-3の上皮染色の同様の定量化は、以前の研究と同様に、染色の程度と強度の半定量的グレーディングを使用して実行されます。 免疫染色の強度と分布は、次の半定量的グレーディング スケールで定量化されます。0 = 染色なし、1 = 軽度のびまん性または中程度の斑状染色。 2 = 中程度のびまん性染色。 3 = 2 人の独立した観察者による上皮、間質、および腺の強いびまん性染色。

-組織学的ステロイド感受性およびステロイド耐性表現型の指定：組織学的に「ステロイド感受性」または「ステロイド耐性」としてのNP被験者の指定は、MFNSによる治療前および1週間後の次の措置に基づいています。

1. NP好酸球の減少の程度 NP炎症の改善、
2. 好酸球、Tリンパ球および上皮細胞におけるアポトーシスの誘導の程度、
3. マイクロアレイ解析に基づく炎症性遺伝子発現抑制の程度。

被験者は、治療に対して最も敏感なものから最も敏感でないものの順にランク付けされます。 線形回帰を使用して、これらの独立した連続変数間の相関を調べます。

マイクロアレイ分析: マイクロアレイ分析を使用して、グローバルな遺伝子 mRNA 発現を評価し、前に取得した「ステロイド感受性」(SS-NP) および「ステロイド耐性」SR-NP 生検におけるプロおよびアンチアポトーシス遺伝子発現に関する情報を取得します。鼻腔内フロ酸モメタゾン（MFNS）による治療の1週間後。 マイクロ アレイ用の RNA 分離は、Arcturus picopure RNA 分離システムを使用して行われます。 プラスチック製の LCM コレクション キャップを 25 マイクロリットルのキットの GITC 含有抽出バッファー中で 42oC で 30 分間インキュベートし、短時間遠心分離して抽出溶液を集め、-80oC で凍結します。 ピコピュア RNA カラムで精製する前に、サンプルを解凍してプールし、カラムでの RNAse フリー DNAse (Qiagen、Hilden、GmbH) 消化によってゲノム DNA を除去します。 各カラムからの全細胞 RNA は 11 マイクロリットルの溶出バッファーで溶出され、RNA-Seq ライブラリーの調製に使用されるか、標準の上付き文字 III (Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド) プロトコル。 また、鼻ポリープに対する遺伝子発現の比較に使用される以前の研究で得られた 8 つの健康な対照中鼻甲介からのマイクロ アレイ データもあります。

RNA は、精製された RNA の完全性を維持するための ScriptGuard™ RNase 阻害剤を含む ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit (EPICENTRE Biotechnologies、Madison、WI) を使用して、患者ごとに 1 つの NP 生検から精製されます。 精製された RNA の品質は、RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA) を使用してチェックされます。 下限感度は200pg/mlで、約1250個の細胞から抽出したRNAの品質を確認することができます。

QRTPCR: RNA 発現プロファイリングによって差次的に発現される遺伝子は、各組織コンパートメントから精製された RNA の個別の少量サンプルからの定量的リアルタイム RT-PCR によってさらに調査されます。 マルチプレックス MX3000P 定量的 RT-PCR システム (Stratagene, La Jolla, CA) を使用して、RT-PCR を実行します。 ベースライン遺伝子発現は、デルタ-デルタ Ct (2-ΔΔ) 法を使用して、GAPDH に対する QRTPCR によって定量化されます。 フォワードおよびリバース プライマーは、primerbank ソフトウェア (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) に基づいて選択されます。 組織内の遺伝子発現を確認するために、以前の研究と同様に免疫組織化学を使用します。