En åpen studie for å identifisere molekylære markører for steroidresistens (MERK2)

Besøk 1: Baseline-evaluering og nasal endoskopi

Ved dette besøket vil hvert forsøksperson signere et informert samtykke, emnets kvalifisering for studien vil bli bekreftet, en medisinsk historie vil bli innhentet, emnet vil gjennomgå en fysisk undersøkelse og neseendoskopi. En uringraviditetstest vil bli utført på alle kvinner i fertil alder. NP-størrelse vil bli registrert ved hjelp av NP-scoringssystemet (se nedenfor).

Allergihudtesting vil kun bli utført hvis det ikke er gjort de siste 3 årene.

Besøk 2: Pre-treatment nasal polypp (NP) biopsier

Ved dette besøket vil hvert individ gjennomgå NP-biopsiene før behandling. Biopsiene vil bli innhentet av Dr. Eric Holbrook ved Massachusetts Eye & Ear Infirmary, som ligger ved siden av MGH.

Besøk 3: Oppstart av behandling med MFNS

Ved dette besøket vil hver forsøksperson få en nesespekulumundersøkelse for å bekrefte at det ikke er noen gjenværende blødning fra NP-biopsiene. Deretter vil forsøkspersonen få en 4 ukers tilførsel av MFNS (Nasonex ®) og bli bedt om å ta 2 sprayer/nesebor BID. Forsøkspersonene vil få en NP-symptomdagbok og instruert om å registrere NP-symptomer daglig i 4 uker.

Hvert forsøksperson vil bli tildelt et unikt nummer (screening eller baseline-nummer) for identifikasjonsformål. Under ingen omstendigheter vil en pasient bli tildelt mer enn ett tildelingsnummer. Nasonex-flaskene vil bli dispensert fra MGH Research Pharmacy.

Besøk 4: NP-biopsi under behandling

Ved dette besøket vil hvert individ gjennomgå NP-biopsier under behandling. Biopsiene vil bli innhentet av Dr. Eric Holbrook ved Massachusetts Eye & Ear Infirmary, som ligger ved siden av MGH. Pasienten vil bli bedt om å holde tilbake Nasonex-behandlingen i 48 timer etter denne biopsien.

Besøk 5: Undersøkelse etter biopsi Ved dette besøket vil hvert forsøksperson få en nesespekulumundersøkelse for å bekrefte at det ikke er gjenværende blødning fra NP-biopsiene. Hvis blødningen har opphørt, vil pasienten gjenoppta Nasonex-behandlingen.

Besøk 5 6: Siste besøk og neseendoskopi

Ved dette besøket vil hvert forsøksperson returnere sine brukte og ubrukte flasker med Nasonex og sende inn sin NP-symptomdagbok og gjennomgå en nasal endoskopi. NP-størrelse vil bli registrert ved hjelp av NP-scoringssystemet (se nedenfor). Forsøkspersonene vil også fullføre en global vurdering av effekten av MFNS for deres NP-symptomer.

EKSPERIMENTELLE PROSEDYRER:

Pre-biopsier eksplantasjonskulturer: vi vil innhente NP biopsier for in vitro eksplantasjonskultur før steroidbehandling fra hver pasient. Vi vil dyrke eksplantatene i MF ved 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M og analysere inflammatorisk celleinfiltrat og steroidsensitivitet basert på induksjon av apoptose (aktivert caspase-3-ekspresjon) i inflammatoriske celleundergrupper, alfa-glatt muskelcelle aktin+ myofibroblaster og epitelceller. Hver tilstand vil bli utført i duplikat slik at én prøve kan behandles for IHC og én for mikroarray.

Eksplantatkulturer: NP-eksplantater vil bli dyrket i minimalt essensielt medium i 24 timer ved 37oC ved bruk av flatbunnede vevskulturplater. Etter 24 timer i kultur vil 1 eksplantasjon per tilstand behandles for IHC og 1 for mikroarray. Vi vil også lagre kultursupernatant fra hver eksplantasjonstilstand for bekreftelse av viktige forskjeller i proteinproduksjon, basert på data fra IHC og mikroarrays.

Immunhistokjemi (IHC) og konfokal laserimmunfluorescensmikroskopi (CLM): Frosne NP-prøver fra SS-NP- og SR-NP-pasienter før og etter MFNS-behandling vil bli analysert med immunfluorescens konfokal lasermikroskopi (IF-CLM) for T-lymfocytt (CD3 og CD4) ), MBP+ eosinofiler, alfa-glattmuskelaktin (markør for aktiverte myofibroblaster, monoklonale, R&D Systems, Inc.) og spaltet caspase-3 (polyklonalt, CST, Beverly, MA). Antall inflammatoriske celler av hver type og spaltede caspase-3 positive og negative celler av hver type vil telles av to observatører som er blindet for behandling og innsamlingsrekkefølge. En lignende kvantifisering av epitelfarging for PCNA (en markør for epitelcelleproliferasjon) og spaltet caspase-3 vil bli utført ved bruk av semikvantitativ gradering av omfang og intensitet av farging som i våre tidligere studier. Intensiteten og distribusjonen av immunfarging vil kvantifiseres på en semikvantitativ karakterskala på: 0 = fraværende farging, 1 = mild diffus eller moderat ujevn farging; 2 = moderat diffus farging; 3 = intens diffus farging i epitel, stroma og kjertler av 2 uavhengige observatører.

Histologisk steroid-sensitive og steroid-resistente fenotypebetegnelse: Betegnelse av NP-individer som histologisk "steroid-sensitive" eller "steroid-resistente" vil være basert på følgende tiltak før og 1 uke etter behandling med MFNS:

1. grad av reduksjon i NP-eosinofiler forbedring i NP-betennelse,
2. grad av induksjon av apoptose i eosinofiler, T-lymfocytter og epitelceller,
3. grad av undertrykkelse av inflammatorisk genuttrykk basert på mikroarray-analyse.

Forsøkspersonene vil bli rangert i rekkefølge fra mest sensitive til minst sensitive for behandling. Lineær regresjon vil bli brukt for å undersøke korrelasjoner mellom disse uavhengige kontinuerlige variablene.

Mikroarray-analyse: mikroarray-analyse vil bli brukt til å vurdere globalt gen-mRNA-uttrykk og også fange informasjon om pro- og anti-apoptotisk genuttrykk i "steroidsensitive" (SS-NP) og "steroidresistente" SR-NP-biopsier oppnådd før og 1. uke etter behandling med intranasal mometasonfuroat (MFNS). RNA-isolering for mikroarray gjøres ved å bruke Arcturus picopure RNA-isolasjonssystem. LCM-oppsamlingshetter av plast inkuberes ved 42oC i 30 minutter i 25 mikroliter av settets GITC-holdige ekstraksjonsbuffer, sentrifugeres kort for å samle opp den ekstraherte løsningen, og fryses deretter ved -80oC. Prøver tines og slås sammen før rensing på pikopure RNA-kolonner, og genomisk DNA fjernes via RNAse-fri DNAse (Qiagen, Hilden, GmbH) fordøyelse på kolonnene. Totalt cellulære RNA fra hver kolonne elueres i 11 mikroliter elueringsbuffer og brukes til fremstilling av RNA-Seq-biblioteket, eller konverteres til cDNA-for QRTPCR-analysen, ved bruk av et totalt reaksjonsvolum på 20 mikroliter via standard superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) protokoll. Vi har også mikroarray-data fra 8 sunne kontroll-mellomturbinater oppnådd i en tidligere studie som vil bli brukt til sammenligning av genuttrykk med nesepolypper.

RNA vil bli renset fra én NP-biopsi per pasient ved å bruke ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit, (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) som inkluderer ScriptGuard™ RNase-hemmer for å opprettholde integriteten til renset RNA. Renset RNA-kvalitet vil bli kontrollert ved hjelp av RNA Nano-analyse (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). Den nedre grensen for følsomhet er 200 pg/ml, noe som gjør at vi kan verifisere kvaliteten på RNA ekstrahert fra ca. 1250 celler.

QRTPCR: Gener som uttrykkes differensielt ved RNA-ekspresjonsprofilering vil bli undersøkt videre ved kvantitativ sanntids RT-PCR fra en separat liten prøve av renset RNA fra hvert vevsrom. RT-PCR vil bli utført ved hjelp av Multiplex MX3000P kvantitative RT-PCR-system (Stratagene, La Jolla, CA). Baseline genuttrykk vil kvantifiseres ved QRTPCR i forhold til GAPDH ved å bruke delta-delta Ct (2-∆∆) metoden. Forover- og reversprimere vil bli valgt basert på primerbank-programvare (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). For å bekrefte genuttrykk i vev vil vi bruke immunhistokjemi som i tidligere studier.