Otevřená studie k identifikaci molekulárních markerů rezistence vůči steroidům (MERK2)

Návštěva 1: Základní hodnocení a nosní endoskopie

Při této návštěvě každý subjekt podepíše informovaný souhlas, bude potvrzena způsobilost subjektu pro studii, bude získána anamnéza, subjekt podstoupí fyzikální vyšetření a nazální endoskopii. Těhotenský test z moči bude proveden u všech žen ve fertilním věku. Velikost NP bude zaznamenána pomocí bodovacího systému NP (viz níže).

Kožní testy na alergii budou provedeny pouze v případě, že nebyly provedeny v posledních 3 letech.

Návštěva 2: Biopsie nosního polypu (NP) před léčbou

Při této návštěvě každý subjekt podstoupí NP biopsie před léčbou. Biopsie získá Dr. Eric Holbrook z Massachusetts Eye & Ear Infirmary, která se nachází vedle MGH.

Návštěva 3: Zahájení léčby MFNS

Při této návštěvě podstoupí každý subjekt vyšetření nosního zrcadla, aby se potvrdilo, že z biopsií NP není žádné reziduální krvácení. Poté bude subjektu podána zásoba MFNS (Nasonex®) na 4 týdny a bude instruován, aby si vzal 2 vstřiky/nosní dírky BID. Subjekty dostanou deník symptomů NP a instruují, aby si zaznamenávaly symptomy NP denně po dobu 4 týdnů.

Každému subjektu bude přiděleno jedinečné číslo (screeningové nebo základní číslo) pro účely identifikace. Za žádných okolností nebude pacientovi přiděleno více než jedno přidělené číslo. Lahvičky Nasonex budou vydávány z MGH Research Pharmacy.

Návštěva 4: Biopsie NP při léčbě

Při této návštěvě každý subjekt podstoupí biopsie NP při léčbě. Biopsie získá Dr. Eric Holbrook z Massachusetts Eye & Ear Infirmary, která se nachází vedle MGH. Subjekt bude požádán, aby přerušil léčbu Nasonexem na 48 hodin po této biopsii.

Návštěva 5: Vyšetření po biopsii Při této návštěvě podstoupí každý subjekt vyšetření nosního zrcátka, aby se potvrdilo, že z NP biopsií není žádné reziduální krvácení. Pokud krvácení ustane, subjekt bude pokračovat v léčbě Nasonexem.

Návštěva 5 6: Závěrečná návštěva a nosní endoskopie

Při této návštěvě každý subjekt vrátí své použité a nepoužité lahvičky Nasonexu a předloží svůj deník příznaků NP a podstoupí nosní endoskopii. Velikost NP bude zaznamenána pomocí bodovacího systému NP (viz níže). Subjekty také dokončí globální hodnocení účinnosti MFNS na jejich symptomy NP.

EXPERIMENTÁLNÍ POSTUPY:

Kultivace explantátů před biopsií: od každého pacienta získáme NP biopsie pro kultivaci explantátu in vitro před léčbou steroidy. Budeme kultivovat explantáty v MF při 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M a analyzovat zánětlivý buněčný infiltrát a citlivost na steroidy na základě indukce apoptózy (aktivovaná exprese kaspázy-3) v podskupiny zánětlivých buněk, alfa-buněčné buňky hladkého svalstva aktin+ myofibroblasty a epiteliální buňky. Každá podmínka bude provedena duplicitně, takže jeden vzorek může být zpracován pro IHC a jeden pro microarray.

Kultury explantátů: NP explantáty budou kultivovány v minimálním základním médiu po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C za použití ploten pro tkáňové kultury s plochým dnem. Po 24 hodinách kultivace bude 1 explantát za podmínek zpracován pro IHC a 1 pro microarray. Uložíme také supernatant kultury z každého explantátu pro potvrzení důležitých rozdílů v produkci proteinu na základě dat z IHC a mikročipů.

Imunohistochemie (IHC) a konfokální laserová imunofluorescenční mikroskopie (CLM): Zmrazené vzorky NP od pacientů s SS-NP a SR-NP před a po léčbě MFNS budou analyzovány imunofluorescenční konfokální laserovou mikroskopií (IF-CLM) na T lymfocyty (CD3 a CD4 ), MBP+ eozinofily, alfa-aktin hladkého svalstva (marker aktivovaných myofibroblastů, monoklonální, R & D Systems, Inc.) a štěpená kaspáza-3 (polyklonální, CST, Beverly, MA). Počet zánětlivých buněk každého typu a odštěpených buněk pozitivních a negativních na kaspázu-3 každého typu bude spočítán dvěma pozorovateli, kteří nejsou zaslepeni léčbou a pořadím odběru. Podobná kvantifikace epiteliálního barvení na PCNA (marker proliferace epiteliálních buněk) a štěpená kaspáza-3 bude provedena pomocí semikvantitativního gradingu rozsahu a intenzity barvení jako v našich předchozích studiích. Intenzita a distribuce imunobarvení bude kvantifikována na semikvantitativní stupnici hodnocení: 0 = nepřítomné barvení, 1 = mírné difuzní nebo středně skvrnité barvení; 2 = mírné difúzní zbarvení; 3 = intenzivní difúzní barvení v epitelu, stromatu a žlázách 2 nezávislými pozorovateli.

Histologické označení fenotypu citlivého na steroidy a rezistence na steroidy: Označení subjektů s NP jako histologicky „citlivé na steroidy“ nebo „rezistentní na steroidy“ bude založeno na následujících opatřeních před a 1 týden po léčbě MFNS:

1. rozsah snížení NP eozinofilů zlepšení u NP zánětu,
2. rozsah indukce apoptózy v eozinofilech, T lymfocytech a epiteliálních buňkách,
3. rozsah suprese zánětlivé genové exprese na základě microarray analýzy.

Subjekty budou seřazeny v pořadí od nejcitlivějších po nejméně citlivé na léčbu. Lineární regrese bude použita ke zkoumání korelací mezi těmito nezávislými spojitými proměnnými.

Microarray analýza: microarray analýza bude použita k posouzení exprese globální genové mRNA a také k zachycení informací o pro- a antiapoptotické genové expresi v biopsiích SR-NP „citlivých na steroidy“ (SS-NP) a „rezistentních na steroidy“ získaných před a 1 týden po léčbě intranazálním mometason furoátem (MFNS). Izolace RNA pro microarray se provádí pomocí systému izolace RNA Arcturus picopure. Plastové sběrné uzávěry LCM se inkubují při 42 °C po dobu 30 minut ve 25 mikrolitrech extrakčního pufru obsahujícího GITC soupravy, krátce se odstředí, aby se shromáždil extrahovaný roztok, a poté se zmrazí na -80 °C. Vzorky jsou rozmraženy a spojeny před purifikací na kolonách picopure RNA a genomová DNA je odstraněna štěpením DNAsou bez RNázy (Qiagen, Hilden, GmbH) na kolonách. Celkové buněčné RNA z každé kolony se eluují v 11 mikrolitrech elučního pufru a použijí se pro přípravu knihovny RNA-Seq nebo se převedou na cDNA-pro test QRTPCR s použitím celkového reakčního objemu 20 mikrolitrů prostřednictvím standardního horního indexu III (Invitrogen, Carlsbad, CA) protokol. Máme také data z mikročipů od 8 zdravých kontrolních středních turbinátů získaná v předchozí studii, která budou použita pro srovnání genové exprese u nosních polypů.

RNA bude purifikována z jedné NP biopsie na pacienta pomocí sady ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit, (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI), která obsahuje ScriptGuard™ RNase Inhibitor k udržení integrity purifikované RNA. Kvalita purifikované RNA bude kontrolována pomocí RNA Nano analýzy (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). Dolní limit citlivosti je 200 pg/ml, což nám umožňuje ověřit kvalitu RNA extrahované z asi 1250 buněk.

QRTPCR: Geny, které jsou odlišně exprimovány profilováním exprese RNA, budou dále zkoumány pomocí kvantitativní RT-PCR v reálném čase ze samostatného malého vzorku purifikované RNA z každého tkáňového kompartmentu. RT-PCR bude prováděna pomocí systému Multiplex MX3000P kvantitativní RT-PCR (Stratagene, La Jolla, CA). Základní genová exprese bude kvantifikována pomocí QRTPCR vzhledem k GAPDH pomocí metody delta-delta Ct (2-∆∆). Dopředné a zpětné primery budou vybrány na základě softwaru banky primerů (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). K potvrzení genové exprese v tkáních použijeme imunohistochemii jako v předchozích studiích.