Uno studio in aperto per identificare i marcatori molecolari della resistenza agli steroidi (MERK2)

Visita 1: Valutazione basale ed endoscopia nasale

A questa visita, ogni soggetto firmerà un consenso informato, l'idoneità del soggetto allo studio sarà confermata, sarà ottenuta una storia medica, il soggetto sarà sottoposto a esame fisico ed endoscopia nasale. Un test di gravidanza sulle urine verrà eseguito su tutte le donne in età fertile. La dimensione NP verrà registrata utilizzando il sistema di punteggio NP (vedi sotto).

Il test cutaneo per l'allergia verrà eseguito solo se non è stato eseguito negli ultimi 3 anni.

Visita 2: biopsie del polipo nasale (NP) pre-trattamento

In questa visita, ogni soggetto verrà sottoposto alle biopsie NP pre-trattamento. Le biopsie saranno ottenute dal Dr. Eric Holbrook presso il Massachusetts Eye & Ear Infirmary, adiacente al MGH.

Visita 3: Inizio del trattamento con MFNS

A questa visita, ogni soggetto avrà un esame dello speculum nasale per confermare che non vi è alcun sanguinamento residuo dalle biopsie NP. Quindi, al soggetto verrà data una fornitura di 4 settimane di MFNS (Nasonex ®) e sarà istruito a prendere 2 spray/narice BID. I soggetti riceveranno un diario dei sintomi NP e istruiti a registrare i sintomi NP ogni giorno per 4 settimane.

Ad ogni soggetto verrà assegnato un numero univoco (screening o numero di riferimento) a scopo identificativo. In nessun caso a un paziente verrà assegnato più di un numero di assegnazione. I flaconi Nasonex saranno dispensati dalla MGH Research Pharmacy.

Visita 4: Biopsia NP in trattamento

In questa visita, ogni soggetto verrà sottoposto al trattamento biopsie NP. Le biopsie saranno ottenute dal Dr. Eric Holbrook presso il Massachusetts Eye & Ear Infirmary, adiacente al MGH. Al soggetto verrà chiesto di sospendere il trattamento con Nasonex per 48 ore dopo questa biopsia.

Visita 5: esame post-biopsia A questa visita, ogni soggetto verrà sottoposto a un esame dello speculum nasale per confermare che non vi è alcun sanguinamento residuo dalle biopsie NP. Se l'emorragia è cessata, il soggetto riprenderà il trattamento con Nasonex.

Visita 5 6: Visita finale ed endoscopia nasale

A questa visita, ogni soggetto restituirà i propri flaconi usati e inutilizzati di Nasonex e presenterà il proprio diario dei sintomi NP e si sottoporrà a un'endoscopia nasale. La dimensione NP verrà registrata utilizzando il sistema di punteggio NP (vedi sotto). I soggetti completeranno anche una valutazione globale dell'efficacia di MFNS per i loro sintomi NP.

PROCEDURE SPERIMENTALI:

Colture di espianti pre-biopsie: otterremo biopsie di NP per colture di espianti in vitro prima del trattamento con steroidi da ciascun paziente. Coltureremo gli espianti in MF a 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M e analizzeremo l'infiltrato cellulare infiammatorio e la sensibilità agli steroidi sulla base dell'induzione dell'apoptosi (espressione della caspasi-3 attivata) in sottoinsiemi di cellule infiammatorie, miofibroblasti di actina delle cellule muscolari lisce alfa e cellule epiteliali. Ogni condizione verrà eseguita in duplicato in modo che un campione possa essere processato per IHC e uno per microarray.

Colture di espianti: Gli espianti di NP saranno coltivati ​​in terreno essenziale minimo per 24 ore a 37°C utilizzando piastre di coltura tissutale a fondo piatto. Dopo 24 ore di coltura, 1 espianto per condizione sarà processato per IHC e 1 per microarray. Salveremo anche il surnatante di coltura da ciascuna condizione di espianto per la conferma di importanti differenze nella produzione di proteine, sulla base dei dati dell'IHC e dei microarray.

Immunoistochimica (IHC) e microscopia a immunofluorescenza laser confocale (CLM): campioni di NP congelati da pazienti SS-NP e SR-NP prima e dopo il trattamento con MFNS saranno analizzati mediante microscopia laser confocale a immunofluorescenza (IF-CLM) per linfociti T (CD3 e CD4 ), eosinofili MBP+, actina del muscolo liscio alfa (marcatore di miofibroblasti attivati, monoclonale, R & D Systems, Inc.) e caspasi-3 scissa (policlonale, CST, Beverly, MA). Il numero di cellule infiammatorie di ciascun tipo e di cellule positive e negative di caspasi-3 scisse di ciascun tipo sarà contato da due osservatori all'oscuro del trattamento e dell'ordine di prelievo. Una quantificazione simile della colorazione epiteliale per PCNA (un marcatore della proliferazione delle cellule epiteliali) e per la caspasi-3 scissa verrà eseguita utilizzando la classificazione semiquantitativa dell'estensione e dell'intensità della colorazione come nei nostri studi precedenti. L'intensità e la distribuzione dell'immunocolorazione saranno quantificate su una scala di grading semi-quantitativa di: 0 = colorazione assente, 1 = colorazione lieve diffusa o moderata a chiazze; 2 = colorazione diffusa moderata; 3 = intensa colorazione diffusa nell'epitelio, nello stroma e nelle ghiandole da parte di 2 osservatori indipendenti.

Designazione istologica del fenotipo steroideo-sensibile e steroido-resistente: la designazione dei soggetti NP come istologicamente "steroido-sensibili" o "steroido-resistenti" si baserà sulle seguenti misure prima e dopo 1 settimana dal trattamento con MFNS:

1. grado di riduzione degli eosinofili NP miglioramento dell'infiammazione NP,
2. grado di induzione dell'apoptosi negli eosinofili, nei linfociti T e nelle cellule epiteliali,
3. grado di soppressione dell'espressione genica infiammatoria basata sull'analisi di microarray.

I soggetti saranno classificati in ordine dal più sensibile al meno sensibile al trattamento. La regressione lineare verrà utilizzata per esaminare le correlazioni tra queste variabili continue indipendenti.

Analisi di microarray: l'analisi di microarray sarà utilizzata per valutare l'espressione genica globale dell'mRNA e anche per acquisire informazioni sull'espressione genica pro e anti-apoptotica in biopsie di SR-NP "steroid sensitive" (SS-NP) e "steroid resistant" ottenute prima e 1 settimana dopo il trattamento con mometasone furoato intranasale (MFNS). L'isolamento dell'RNA per il microarray viene effettuato utilizzando il sistema di isolamento dell'RNA picopuro Arcturus. I tappi di raccolta LCM in plastica vengono incubati a 42°C per 30 minuti in 25 microlitri del tampone di estrazione contenente GITC del kit, centrifugati brevemente per raccogliere la soluzione estratta, quindi congelati a -80°C. I campioni vengono scongelati e riuniti in pool prima della purificazione su colonne di RNA picopuro e il DNA genomico viene rimosso tramite la digestione DNAsi priva di RNAsi (Qiagen, Hilden, GmbH) sulle colonne. Gli RNA cellulari totali di ciascuna colonna vengono eluiti in 11 microlitri di tampone di eluizione e utilizzati per la preparazione della libreria RNA-Seq, o convertiti in cDNA per il saggio QRTPCR, utilizzando un volume di reazione totale di 20 microlitri tramite l'apice standard III (Invitrogen, Protocollo di Carlsbad, CA). Abbiamo anche dati di microarray da 8 turbinati medi di controllo sani ottenuti in uno studio precedente che verranno utilizzati per il confronto dell'espressione genica con i polipi nasali.

L'RNA sarà purificato da una biopsia NP per paziente utilizzando il kit di purificazione dell'RNA su scala nanometrica ArrayPure™, (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) che include l'inibitore dell'RNasi ScriptGuard™ per mantenere l'integrità dell'RNA purificato. La qualità dell'RNA purificato sarà controllata mediante RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). La sensibilità del limite inferiore è di 200 pg/ml, permettendoci di verificare la qualità dell'RNA estratto da circa 1250 cellule.

QRTPCR: I geni che sono differenzialmente espressi dal profilo di espressione dell'RNA saranno ulteriormente studiati mediante RT-PCR quantitativa in tempo reale da un piccolo campione separato di RNA purificato da ciascun compartimento tissutale. La RT-PCR sarà eseguita utilizzando il sistema di RT-PCR quantitativa Multiplex MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA). L'espressione genica di base sarà quantificata mediante QRTPCR rispetto a GAPDH utilizzando il metodo delta-delta Ct (2-∆∆). I primer forward e reverse saranno selezionati sulla base del software primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Per confermare l'espressione genica all'interno dei tessuti utilizzeremo l'immunoistochimica come negli studi precedenti.