Otwarte badanie mające na celu identyfikację molekularnych markerów oporności na sterydy (MERK2)

Wizyta 1: Ocena wyjściowa i endoskopia nosa

Podczas tej wizyty każdy pacjent podpisze świadomą zgodę, zostanie potwierdzone zakwalifikowanie pacjenta do badania, uzyskany zostanie wywiad lekarski, pacjent zostanie poddany badaniu fizykalnemu i endoskopii nosa. U wszystkich kobiet w wieku rozrodczym zostanie przeprowadzony test ciążowy z moczu. Rozmiar NP zostanie zarejestrowany przy użyciu systemu punktacji NP (patrz poniżej).

Testy skórne na alergię będą wykonywane tylko wtedy, gdy nie były wykonywane w ciągu ostatnich 3 lat.

Wizyta 2: Biopsje polipów nosa (NP) przed leczeniem

Podczas tej wizyty każdy pacjent zostanie poddany biopsji NP przed leczeniem. Biopsje zostaną wykonane przez dr Erica Holbrooka w szpitalu Massachusetts Eye & Ear Infirmary, położonym w sąsiedztwie MGH.

Wizyta 3: Rozpoczęcie leczenia MFNS

Podczas tej wizyty każdy pacjent zostanie poddany badaniu przez wziernik nosowy w celu potwierdzenia, że ​​nie ma pozostałości krwawienia z biopsji NP. Następnie osobnik otrzyma zapas MFNS (Nasonex®) na 4 tygodnie i zostanie poinstruowany, aby przyjmował 2 spraye/do nozdrza BID. Osobnicy otrzymają dzienniczek objawów NP i zostaną poinstruowani, aby codziennie zapisywać objawy NP przez 4 tygodnie.

Każdemu pacjentowi zostanie przydzielony niepowtarzalny numer (numer przesiewowy lub numer wyjściowy) w celach identyfikacyjnych. W żadnym wypadku pacjentowi nie zostanie przydzielony więcej niż jeden numer przydziału. Butelki Nasonex będą wydawane z Apteki Badawczej MGH.

Wizyta 4: Biopsja NP w trakcie leczenia

Podczas tej wizyty każdy pacjent zostanie poddany biopsji NP w trakcie leczenia. Biopsje zostaną wykonane przez dr Erica Holbrooka w szpitalu Massachusetts Eye & Ear Infirmary, położonym w sąsiedztwie MGH. Pacjent zostanie poproszony o wstrzymanie leczenia Nasonexem przez 48 godzin po tej biopsji.

Wizyta 5: Badanie po biopsji Podczas tej wizyty każdy pacjent zostanie poddany badaniu przez wziernik nosowy w celu potwierdzenia, że ​​nie ma pozostałości krwawienia z biopsji NP. Jeśli krwawienie ustanie, pacjent wznowi leczenie produktem Nasonex.

Wizyta 5 6: Wizyta końcowa i endoskopia nosa

Podczas tej wizyty każdy pacjent zwróci zużyte i niewykorzystane butelki Nasonexu i przedłoży dzienniczek objawów NP oraz przejdzie endoskopię nosa. Rozmiar NP zostanie zarejestrowany przy użyciu systemu punktacji NP (patrz poniżej). Pacjenci przeprowadzą również ogólną ocenę skuteczności MFNS w przypadku objawów NP.

EKSPERYMENTALNE PROCEDURY:

Hodowle eksplantatów przed biopsjami: od każdego pacjenta uzyskamy biopsje NP do hodowli eksplantatów in vitro przed leczeniem sterydami. Będziemy hodować eksplantaty w MF w 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M i analizować naciek z komórek zapalnych i wrażliwość na steroidy w oparciu o indukcję apoptozy (ekspresję aktywowanej kaspazy-3) w podzbiory komórek zapalnych, aktyna komórek mięśni gładkich alfa + miofibroblasty i komórki nabłonkowe. Każdy warunek zostanie powtórzony, aby jedna próbka mogła zostać przetworzona do IHC, a druga do mikromacierzy.

Hodowle eksplantatów: Eksplantaty NP będą hodowane w pożywce minimalnej niezbędnej przez 24 godziny w temperaturze 37oC na płaskodennych płytkach do hodowli tkankowych. Po 24 godzinach w hodowli, 1 eksplant na każdy warunek zostanie przetworzony do IHC i 1 do mikromacierzy. Zachowamy również supernatant hodowli z każdego warunku eksplantacji w celu potwierdzenia istotnych różnic w produkcji białka, w oparciu o dane z IHC i mikromacierzy.

Immunohistochemia (IHC) i konfokalna laserowa mikroskopia immunofluorescencyjna (CLM): Zamrożone próbki NP od pacjentów z SS-NP i SR-NP przed i po leczeniu MFNS zostaną przeanalizowane za pomocą immunofluorescencyjnej konfokalnej mikroskopii laserowej (IF-CLM) pod kątem limfocytów T (CD3 i CD4 ), MBP + eozynofile, alfa-aktyna mięśni gładkich (marker aktywowanych miofibroblastów, monoklonalny, R & D Systems, Inc.) i rozszczepiona kaspaza-3 (poliklonalna, CST, Beverly, MA). Liczba komórek zapalnych każdego typu i rozszczepionych komórek dodatnich i ujemnych kaspazy-3 każdego typu zostanie zliczona przez dwóch obserwatorów, którzy nie znają traktowania i kolejności zbierania. Podobna ocena ilościowa barwienia nabłonka dla PCNA (marker proliferacji komórek nabłonka) i rozszczepionej kaspazy-3 zostanie przeprowadzona przy użyciu półilościowej oceny stopnia i intensywności barwienia, jak w naszych poprzednich badaniach. Intensywność i rozmieszczenie wybarwienia immunologicznego będzie oceniane ilościowo na półilościowej skali ocen: 0 = brak wybarwienia, 1 = wybarwienie łagodne rozproszone lub umiarkowane plamiste; 2 = umiarkowane zabarwienie rozproszone; 3 = intensywne rozproszone barwienie nabłonka, zrębu i gruczołów przez 2 niezależnych obserwatorów.

Histologiczne oznaczenie fenotypu wrażliwości na steroidy i oporności na steroidy: Oznaczenie pacjentów z NP jako histologicznie „wrażliwych na steroidy” lub „opornych na steroidy” będzie oparte na następujących pomiarach przed i 1 tydzień po leczeniu MFNS:

1. stopień redukcji liczby eozynofilów NP poprawa stanu zapalnego NP,
2. stopień indukcji apoptozy w eozynofilach, limfocytach T i komórkach nabłonkowych,
3. stopień supresji ekspresji genów zapalnych na podstawie analizy mikromacierzy.

Pacjenci zostaną uszeregowani w kolejności od najbardziej wrażliwej do najmniej wrażliwej na leczenie. Regresja liniowa zostanie wykorzystana do zbadania korelacji między tymi niezależnymi zmiennymi ciągłymi.

Analiza mikromacierzy: analiza mikromacierzy zostanie wykorzystana do oceny globalnej ekspresji mRNA genów, a także do zebrania informacji na temat ekspresji genów pro- i antyapoptotycznych w biopsjach SR-NP „wrażliwych na steroidy” (SS-NP) i „opornych na steroidy” uzyskanych przed i 1 tydzień po leczeniu donosowym furoinianem mometazonu (MFNS). Izolację RNA do mikromacierzy wykonuje się przy użyciu systemu izolacji RNA Arcturus picopure. Plastikowe nasadki do zbierania LCM inkubuje się w temperaturze 42oC przez 30 minut w 25 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego zawierającego GITC z zestawu, krótko odwirowuje w celu zebrania wyekstrahowanego roztworu, a następnie zamraża w temperaturze -80oC. Próbki rozmraża się i łączy w pule przed oczyszczaniem na kolumnach picopur RNA, a genomowy DNA usuwa się przez trawienie na kolumnach DNAzą wolną od RNAzy (Qiagen, Hilden, GmbH). Całkowite komórkowe RNA z każdej kolumny eluuje się w 11 mikrolitrach buforu do elucji i stosuje do przygotowania biblioteki RNA-Seq lub przekształca w cDNA do testu QRTPCR, stosując całkowitą objętość reakcji 20 mikrolitrów za pomocą standardowego indeksu górnego III (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia). Mamy również dane z mikromacierzy z 8 zdrowych kontrolnych małżowin nosowych uzyskanych w poprzednim badaniu, które zostaną wykorzystane do porównania ekspresji genów z polipami nosa.

RNA zostanie oczyszczone z jednej biopsji NP na pacjenta przy użyciu zestawu ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI), który zawiera inhibitor ScriptGuard™ RNazy w celu utrzymania integralności oczyszczonego RNA. Jakość oczyszczonego RNA zostanie sprawdzona za pomocą RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). Dolna granica czułości wynosi 200 pg/ml, co pozwala na weryfikację jakości RNA wyekstrahowanego z około 1250 komórek.

QRTPCR: Geny, które ulegają zróżnicowanej ekspresji poprzez profilowanie ekspresji RNA, będą dalej badane za pomocą ilościowej reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym z oddzielnej małej próbki oczyszczonego RNA z każdego przedziału tkankowego. RT-PCR zostanie przeprowadzony przy użyciu ilościowego systemu RT-PCR Multiplex MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA). Wyjściowa ekspresja genów zostanie określona ilościowo za pomocą QRTPCR względem GAPDH przy użyciu metody delta-delta Ct (2-∆∆). Startery do przodu i do tyłu zostaną wybrane na podstawie oprogramowania primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Aby potwierdzić ekspresję genów w tkankach, użyjemy immunohistochemii, podobnie jak w poprzednich badaniach.