Un estudio abierto para identificar marcadores moleculares de resistencia a esteroides (MERK2)

Visita 1: Evaluación basal y endoscopia nasal

En esta visita, cada sujeto firmará un consentimiento informado, se confirmará la elegibilidad del sujeto para el estudio, se obtendrá un historial médico, se le realizará un examen físico y una endoscopia nasal. Se realizará una prueba de embarazo en orina a todas las mujeres en edad fértil. El tamaño de NP se registrará utilizando el sistema de puntuación de NP (ver más abajo).

Las pruebas cutáneas de alergia solo se realizarán si no se han realizado en los últimos 3 años.

Visita 2: Biopsias de pólipos nasales (NP) previas al tratamiento

En esta visita, cada sujeto se someterá a las biopsias NP previas al tratamiento. Las biopsias serán obtenidas por el Dr. Eric Holbrook en Massachusetts Eye & Ear Infirmary, ubicado junto a MGH.

Visita 3: Inicio de tratamiento con MFNS

En esta visita, a cada sujeto se le realizará un examen con espéculo nasal para confirmar que no haya sangrado residual de las biopsias NP. Luego, al sujeto se le dará un suministro de MFNS (Nasonex ®) para 4 semanas y se le indicará que tome 2 aerosoles/fosa nasal BID. Los sujetos recibirán un diario de síntomas de NP y se les indicará que registren los síntomas de NP diariamente durante 4 semanas.

A cada sujeto se le asignará un número único (número de selección o de referencia) con fines de identificación. En ningún caso se asignará a un paciente más de un número de asignación. Los frascos de Nasonex se dispensarán desde MGH Research Pharmacy.

Visita 4: Biopsia del PN durante el tratamiento

En esta visita, cada sujeto se someterá a las biopsias NP durante el tratamiento. Las biopsias serán obtenidas por el Dr. Eric Holbrook en Massachusetts Eye & Ear Infirmary, ubicado junto a MGH. Se le pedirá al sujeto que suspenda el tratamiento con Nasonex durante 48 horas después de esta biopsia.

Visita 5: Examen posterior a la biopsia En esta visita, a cada sujeto se le realizará un examen con espéculo nasal para confirmar que no haya sangrado residual de las biopsias NP. Si ha cesado el sangrado, el sujeto reanudará el tratamiento con Nasonex.

Visita 5 6: Visita final y endoscopia nasal

En esta visita, cada sujeto devolverá sus botellas de Nasonex usadas y sin usar y enviará su diario de síntomas de NP y se someterá a una endoscopia nasal. El tamaño de NP se registrará utilizando el sistema de puntuación de NP (ver más abajo). Los sujetos también completarán una evaluación global de la eficacia de MFNS para sus síntomas de NP.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES:

Cultivos de explantes pre-biopsias: obtendremos biopsias NP para cultivo de explantes in vitro antes del tratamiento con esteroides de cada paciente. Cultivaremos los explantes en MF a 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M y analizaremos el infiltrado de células inflamatorias y la sensibilidad a los esteroides en función de la inducción de apoptosis (expresión de caspasa-3 activada) en subconjuntos de células inflamatorias, miofibroblastos de actina de células musculares lisas alfa y células epiteliales. Cada condición se realizará por duplicado para que una muestra pueda procesarse para IHC y otra para microarrays.

Cultivos de explantes: los explantes de NP se cultivarán en medio mínimo esencial durante 24 horas a 37 °C utilizando placas de cultivo de tejidos de fondo plano. Después de 24 horas en cultivo, se procesará 1 explante por condición para IHC y 1 para microarray. También guardaremos el sobrenadante de cultivo de cada condición de explante para confirmar diferencias importantes en la producción de proteínas, según los datos de la IHC y los microarrays.

Inmunohistoquímica (IHC) y microscopía de inmunofluorescencia láser confocal (CLM): Las muestras NP congeladas de pacientes SS-NP y SR-NP antes y después del tratamiento con MFNS se analizarán mediante microscopía láser confocal de inmunofluorescencia (IF-CLM) para linfocitos T (CD3 y CD4). ), eosinófilos MBP+, actina de músculo liso alfa (marcador de miofibroblastos activados, monoclonal, R & D Systems, Inc.) y caspasa-3 escindida (policlonal, CST, Beverly, MA). El número de células inflamatorias de cada tipo y de células positivas y negativas de caspasa-3 escindidas de cada tipo será contado por dos observadores ciegos al tratamiento y orden de recolección. Se realizará una cuantificación similar de tinción epitelial para PCNA (un marcador de proliferación de células epiteliales) y caspasa-3 escindida mediante la clasificación semicuantitativa de la extensión y la intensidad de la tinción como en nuestros estudios anteriores. La intensidad y la distribución de la inmunotinción se cuantificarán en una escala de clasificación semicuantitativa de: 0 = ausencia de tinción, 1 = tinción leve difusa o moderada en parches; 2 = tinción difusa moderada; 3 = tinción difusa intensa en el epitelio, estroma y glándulas por 2 observadores independientes.

Designación histológica del fenotipo sensible a los esteroides y resistente a los esteroides: la designación de sujetos NP como histológicamente "sensibles a los esteroides" o "resistentes a los esteroides" se basará en las siguientes medidas antes y 1 semana después del tratamiento con MFNS:

1. grado de reducción de los eosinófilos del NP mejora de la inflamación del NP,
2. grado de inducción de la apoptosis en eosinófilos, linfocitos T y células epiteliales,
3. grado de supresión de la expresión génica inflamatoria basada en análisis de micromatrices.

Los sujetos se clasificarán en orden de los más sensibles a los menos sensibles al tratamiento. Se utilizará la regresión lineal para examinar las correlaciones entre estas variables continuas independientes.

Análisis de micromatrices: el análisis de micromatrices se utilizará para evaluar la expresión de ARNm de genes globales y también para capturar información sobre la expresión de genes proapoptóticos y antiapoptóticos en biopsias de SR-NP "sensible a esteroides" (SS-NP) y "resistentes a esteroides" obtenidas antes y 1 semana después del tratamiento con furoato de mometasona intranasal (MFNS). El aislamiento de ARN para microarrays se realiza mediante el sistema de aislamiento de ARN Arcturus picopure. Las tapas colectoras de LCM de plástico se incuban a 42 °C durante 30 minutos en 25 microlitros del tampón de extracción que contiene GITC del kit, se centrifugan brevemente para recolectar la solución extraída y luego se congelan a -80 °C. Las muestras se descongelan y se agrupan antes de la purificación en columnas de ARN picopuro, y el ADN genómico se elimina mediante digestión con ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, GmbH) en las columnas. Los ARN celulares totales de cada columna se eluyen en 11 microlitros de tampón de elución y se usan para la preparación de la biblioteca de ARN-Seq, o se convierten en ADNc para el ensayo QRTPCR, usando un volumen de reacción total de 20 microlitros a través del superíndice estándar III (Invitrogen, Carlsbad, CA) protocolo. También tenemos datos de micromatrices de 8 cornetes medios de control sanos obtenidos en un estudio anterior que se usarán para comparar la expresión génica con los pólipos nasales.

El ARN se purificará a partir de una biopsia de NP por paciente mediante el kit de purificación de ARN a escala nanométrica ArrayPure™ (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) que incluye el inhibidor de ARNasa ScriptGuard™ para mantener la integridad del ARN purificado. La calidad del ARN purificado se comprobará mediante el análisis Nano de ARN (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). El límite inferior de sensibilidad es de 200 pg/ml, lo que nos permite verificar la calidad del ARN extraído de unas 1250 células.

QRTPCR: los genes que se expresan diferencialmente mediante el perfil de expresión de ARN se investigarán más a fondo mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real a partir de una pequeña muestra separada de ARN purificado de cada compartimento de tejido. La RT-PCR se realizará utilizando el sistema de RT-PCR cuantitativa Multiplex MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA). La expresión génica inicial se cuantificará mediante QRTPCR en relación con GAPDH utilizando el método delta-delta Ct (2-∆∆). Los cebadores directos e inversos se seleccionarán en función del software primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Para confirmar la expresión génica dentro de los tejidos, utilizaremos la inmunohistoquímica como en estudios anteriores.