Avoin tutkimus steroidiresistenssin molekyylimarkkerien tunnistamiseksi (MERK2)
Avoin tutkimus nenäpolypoosin steroidiresistenssin molekyylimarkkerien tunnistamiseksi ennen ja jälkeen mometasonifuroaattihoidon (MFNS) 2 suihketta/sieraimella (100 mikrogrammaa/sieraimella) kahdesti päivässä 4 viikon ajan.
Tavoite 1: Arvioida steroidiherkkyyttä mometasonifuroaatille (MF) viljellyssä nenäpolyyppieksplanttikudoksessa in vitro.
Tavoite 2: Arvioida steroidiherkkyyttä in vivo kussakin koehenkilössä vertaamalla oirepisteitä, nenän endoskopialöydöksiä ennen ja jälkeen 4 viikon mometasonifuroaattinenäsumutehoidon (MFNS) ja vertaamalla kudosten immunohistologiaa NP-biopsioissa ennen hoitoa ja sen jälkeen A:lla. MFNS.
Tavoite 3: Luonnehtia geenin mRNA:n ilmentymisen molekyylisignatuuri "steroidiherkässä" ja "steroidiresistentissä" NP:ssä käyttämällä mikrosirua NP-kudoksessa ennen ja jälkeen MFNS-käsittelyn.
Hypoteesi 1: Geenit, jotka säätelevät apoptoosia, ovat säätelemättömiä nenäpolyyppien (NP) tulehdussoluissa, epiteelisoluissa ja sileän lihaksen aktiinimyofibroblasteissa, mikä johtaa tulehdussolujen infiltraation jatkumiseen ja epänormaaliin epiteeli- ja myofibroblastisolujen lisääntymiseen. Nämä voidaan korjata mometasonilla. Apoptoosia säätelevät geenit, joita mometasoni ei voi korjata, säätelevät ylösalaisin steroidiresistentissä NP:ssä.
Tämän säätelyhäiriön selvittäminen voi osoittautua oivaltavaksi, kun ymmärretään mometasonin vaikutusmekanismi NP:ssä ja tunnistetaan mahdollisia molekyylikohteita, jotka lisäävät steroidiherkkyyttä tai päinvastoin voittavat steroidiresistenssin.
Hypoteesi 2: NP:ssä on geenin ilmentymisen molekulaarinen allekirjoitus, joka merkitsee steroidiherkkää NP:tä (SS-NP). Tämä allekirjoitus on muuttunut steroidiresistentissä NP:ssä (SR-NP).
SS-NP:n ja SR-NP:n molekylaarisen allekirjoituksen erojen selvittäminen ennen ja jälkeen mometasonifuroaattihoitoa (MFNS) antaa uudenlaisen käsityksen NP:n hoidosta steroideilla.
Tutkimuksen yleiskatsaus
Yksityiskohtainen kuvaus
Käynti 1: Lähtötilanteen arviointi ja nenän endoskopia
Tällä käynnillä jokainen tutkittava allekirjoittaa tietoisen suostumuksen, tutkittavan kelpoisuus tutkimukseen varmistetaan, sairaushistoria hankitaan, koehenkilölle tehdään fyysinen tutkimus ja nenän endoskopia. Kaikille hedelmällisessä iässä oleville naisille tehdään virtsaraskaustesti. NP-koko tallennetaan käyttämällä NP-pisteytysjärjestelmää (katso alla).
Allergiatesti tehdään vain, jos sitä ei ole tehty viimeisten 3 vuoden aikana.
Käynti 2: Nenäpolyyppi (NP) -biopsiat ennen hoitoa
Tällä vierailulla jokaiselle koehenkilölle tehdään esikäsittelyä edeltävät NP-biopsiat. Biopsiat ottaa tohtori Eric Holbrook Massachusetts Eye & Ear Infirmarysta, joka sijaitsee MGH:n vieressä.
Vierailu 3: MFNS-hoidon aloittaminen
Tällä käynnillä jokaiselle koehenkilölle tehdään nenäpehmuttitutkimus sen varmistamiseksi, ettei NP-biopsioista ole jäännösverenvuotoa. Sitten koehenkilölle annetaan 4 viikon MFNS (Nasonex®) annos ja opastetaan ottamaan 2 suihketta sieraimeen BID. Koehenkilöille annetaan NP-oirepäiväkirja ja heitä neuvotaan kirjaamaan NP-oireet päivittäin 4 viikon ajan.
Jokaiselle koehenkilölle annetaan yksilöllinen numero (seulonta- tai perusnumero) tunnistamista varten. Potilaalle ei missään tapauksessa anneta useampaa kuin yhtä jakonumeroa. Nasonex-pullot jaetaan MGH Research Pharmacysta.
Vierailu 4: NP-biopsia hoidon aikana
Tällä vierailulla jokaiselle koehenkilölle tehdään hoidon aikana NP-biopsiat. Biopsiat ottaa tohtori Eric Holbrook Massachusetts Eye & Ear Infirmarysta, joka sijaitsee MGH:n vieressä. Potilasta pyydetään pidättämään Nasonex-hoito 48 tunnin ajan tämän biopsian jälkeen.
Vierailu 5: Biopsian jälkeinen koe Tällä käynnillä jokaiselle koehenkilölle tehdään nenän tähystintutkimus sen varmistamiseksi, ettei NP-biopsioista ole jäännösverenvuotoa. Jos verenvuoto on lakannut, henkilö jatkaa Nasonex-hoitoa.
Käynti 5 6: Viimeinen käynti ja nenän endoskopia
Tällä käynnillä jokainen tutkittava palauttaa käytetyt ja käyttämättömät Nasonex-pullonsa ja lähettää NP-oirepäiväkirjansa ja joutuu nenän endoskopiaan. NP-koko tallennetaan käyttämällä NP-pisteytysjärjestelmää (katso alla). Koehenkilöt suorittavat myös maailmanlaajuisen arvioinnin MFNS:n tehokkuudesta NP-oireidensa suhteen.
KOKEELLISET MENETTELYT:
Eksplanttiviljelmät ennen biopsiaa: hankimme jokaiselta potilaalta NP-biopsiat in vitro -eksplanttiviljelmää varten ennen steroidihoitoa. Viljelemme eksplantteja MF:ssä 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M ja analysoimme tulehdussolujen infiltraattia ja steroidiherkkyyttä apoptoosin induktion (aktivoitu kaspaasi-3:n ilmentyminen) perusteella. tulehdussolujen alajoukot, alfa-sileälihassolujen aktiini+ myofibroblastit ja epiteelisolut. Jokainen ehto suoritetaan kahtena kappaleena, jotta yksi näyte voidaan käsitellä IHC:tä ja yksi mikrosirua varten.
Eksplantaattiviljelmät: NP-eksplantteja viljellään minimaalisessa välttämättömässä alustassa 24 tuntia 37 oC:ssa tasapohjaisilla kudosviljelylevyillä. 24 tunnin viljelyn jälkeen 1 eksplantti kutakin tilaa kohti käsitellään IHC:tä varten ja 1 mikrosirua varten. Säästämme myös viljelysupernatanttia kustakin eksplanttiolosuhteista varmistaaksemme tärkeät erot proteiinituotannossa IHC:n ja mikrosirujen tietojen perusteella.
Immunohistokemia (IHC) ja konfokaalinen laserimmunofluoresenssimikroskopia (CLM): Jäädytetyt NP-näytteet SS-NP- ja SR-NP-potilailta ennen ja jälkeen MFNS-hoidon analysoidaan immunofluoresenssikonfokaalilasermikroskoopilla (IF-CLM) T-lymfosyyttien (CD3 ja CD4) suhteen. ), MBP+-eosinofiilit, alfa-sileän lihaksen aktiini (aktivoituneiden myofibroblastien merkkiaine, monoklonaalinen, R & D Systems, Inc.) ja pilkottu kaspaasi-3 (polyklonaalinen, CST, Beverly, MA). Jokaisen tyypin tulehdussolujen ja kunkin tyypin pilkkoutuneiden kaspaasi-3-positiivisten ja -negatiivisten solujen lukumäärä laskee kaksi tarkkailijaa, jotka ovat sokeutuneet hoidolle ja keräysjärjestykseen. Samanlainen epiteelin värjäytymisen kvantifiointi PCNA:lle (epiteelisolujen lisääntymisen merkkiaine) ja katkaistulle kaspaasi-3:lle suoritetaan käyttämällä värjäytymisen laajuuden ja intensiteetin semikvantitatiivista luokittelua kuin aiemmissa tutkimuksissamme. Immunovärjäytymisen intensiteetti ja jakautuminen kvantitoidaan puolikvantitatiivisella asteikolla: 0 = värjäytymisen puuttuminen, 1 = lievä diffuusi tai kohtalainen hajanainen värjäytyminen; 2 = kohtalainen diffuusi värjäys; 3 = intensiivinen diffuusi värjäytyminen epiteelissä, stroomassa ja rauhasissa 2 riippumattoman tarkkailijan toimesta.
Histologinen steroidiherkän ja steroidiresistentin fenotyyppinimitys: NP-potilaiden luokittelu histologisesti "steroidiherkiksi" tai "steroidiresistentiksi" perustuu seuraaviin toimenpiteisiin ennen MFNS-hoitoa ja 1 viikon kuluttua sen jälkeen:
- NP-eosinofiilien vähenemisen laajuus, paraneminen NP-tulehduksessa,
- apoptoosin induktion laajuus eosinofiileissä, T-lymfosyyteissä ja epiteelisoluissa,
- tulehduksellisen geeniekspression suppression laajuus microarray-analyysin perusteella.
Kohteet asetetaan järjestykseen herkimmästä hoidolle vähiten herkimpään. Lineaarista regressiota käytetään näiden riippumattomien jatkuvien muuttujien välisten korrelaatioiden tutkimiseen.
Microarray-analyysi: microarray-analyysiä käytetään globaalin geenin mRNA:n ilmentymisen arvioimiseen ja myös tietojen keräämiseen pro- ja anti-apoptoottisesta geeniekspressiosta "steroidiherkissä" (SS-NP) ja "steroidiresistenteissä" SR-NP-biopsioissa, jotka on saatu ennen ja 1. viikon intranasaalisen mometasonifuroaattihoidon (MFNS) jälkeen. RNA-eristys mikrosirua varten tehdään käyttämällä Arcturus picopuren RNA-eristysjärjestelmää. Muovisia LCM-keräyskorkkeja inkuboidaan 42 oC:ssa 30 minuuttia 25 mikrolitrassa pakkauksen GITC:tä sisältävää uuttopuskuria, sentrifugoidaan lyhyesti uutetun liuoksen keräämiseksi, sitten jäädytetään -80 oC:ssa. Näytteet sulatetaan ja yhdistetään ennen puhdistusta pikopure-RNA-kolonneilla, ja genominen DNA poistetaan RNAasittomalla DNAase-digestiolla (Qiagen, Hilden, GmbH) kolonneissa. Solujen kokonais-RNA:t kustakin pylväästä eluoidaan 11 mikrolitrassa eluointipuskuria ja käytetään RNA-Seq-kirjaston valmistukseen tai muunnetaan cDNA:ksi QRTPCR-määritystä varten käyttämällä 20 mikrolitran kokonaisreaktiotilavuutta standardin yläindeksi III:n (Invitrogen, Carlsbad, CA) protokolla. Meillä on myös mikrosirutietoja kahdeksasta terveestä vertailukeskimurskaasta, jotka on saatu aikaisemmassa tutkimuksessa ja joita käytetään geenin ilmentymisen vertaamiseen nenäpolyypeihin.
RNA puhdistetaan yhdestä NP-biopsiasta potilasta kohti käyttämällä ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit -sarjaa (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI), joka sisältää ScriptGuard™ RNaasi-inhibiittorin puhdistetun RNA:n eheyden ylläpitämiseksi. Puhdistetun RNA:n laatu tarkistetaan käyttämällä RNA Nano Analysis -ohjelmaa (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). Alempi herkkyysraja on 200 pg/ml, jolloin voimme varmistaa noin 1250 solusta uutetun RNA:n laadun.
QRTPCR: Geenit, jotka ilmentyvät eri tavalla RNA-ekspressioprofiloinnin avulla, tutkitaan edelleen kvantitatiivisella reaaliaikaisella RT-PCR:llä erillisestä pienestä puhdistetun RNA:n näytteestä kustakin kudososastosta. RT-PCR suoritetaan käyttämällä Multiplex MX3000P kvantitatiivista RT-PCR-järjestelmää (Stratagene, La Jolla, CA). Perustason geeniekspressio kvantifioidaan QRTPCR:llä suhteessa GAPDH:hen käyttäen delta-delta Ct (2-∆∆) -menetelmää. Eteenpäin ja taaksepäin alukkeet valitaan primerbank-ohjelmiston perusteella (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Geeni-ilmentymisen vahvistamiseksi kudoksissa käytämme immunohistokemiaa kuten aikaisemmissa tutkimuksissa.
Opintotyyppi
Ilmoittautuminen (Todellinen)
Vaihe
- Vaihe 4
Yhteystiedot ja paikat
Opiskelupaikat
-
-
Massachusetts
-
Boston, Massachusetts, Yhdysvallat, 02114
- Massachusetts General Hospital
-
-
Osallistumiskriteerit
Kelpoisuusvaatimukset
Opintokelpoiset iät
Hyväksyy terveitä vapaaehtoisia
Sukupuolet, jotka voivat opiskella
Kuvaus
Sisällyttämiskriteerit:
- Tutkittavan on täytettävä kaikki seuraavat ehdot tai ominaisuudet, jotta hänet voidaan ottaa huomioon ilmoittautumisessa:
- Mies tai nainen iältään 21–70 vuotta, asuu Bostonin alueella
Aiempi krooninen rinosinuiitti (oireet vähintään 3 kuukautta). Aiheella on oltava kaksi tai useampi seuraavista:
- Kasvojen kipu/paine tai päänsärky
- Nenän tukkoisuus
- Anterior tai posterior nenän tyhjennys
- Hyposmia/anosmia
- Epänormaali CT-skannaus vähintään 2 poskionteloiden alueella 3 kuukauden sisällä
Todisteet kahdenvälisistä polyypeistä tai polypoidisista limakalvoista (nenän endoskopiassa) polyyppien/polypoidin vähimmäispistemäärällä 4 (katso pisteytysjärjestelmä alla).
Poissulkemiskriteerit:
- 4. Aiempi immuunipuutos (esim. ne, joilla on ollut > yksi keuhkokuume viimeisten 12 kuukauden aikana tai joilla on tunnettu immuunivajaus).
- Aiemmin kystinen fibroosi, Kartagenerin oireyhtymä, liikkumattomien värekärojen oireyhtymä, hypogammaglobulinemia tai verenvuotohäiriö
- URI kuuden viikon sisällä ennen ilmoittautumista
- Intranasaalinen kokaiinin käyttö
- Raskaus (jos mahdollista
Pyörtymisen historia
LÄÄKKEIDEN POIKKEUKSET ennen NP-biopsioita:
- Reseptimääräisten verenohennusaineiden käyttö
- Systeemisten glukokortikoidien käyttö kahden viikon ajan ennen ilmoittautumista
- Intranasaalisten kortikosteroidien ja antikolinergisten lääkkeiden käyttö kolmen päivän ajan ennen ilmoittautumista
- Antibiootin käyttö kolmen päivän ajan ennen ilmoittautumista
- Antihistamiinien käyttö viikon ajan ennen ilmoittautumista
Opintosuunnitelma
Miten tutkimus on suunniteltu?
Suunnittelun yksityiskohdat
- Ensisijainen käyttötarkoitus: BASIC_SCIENCE
- Jako: NA
- Inventiomalli: SINGLE_GROUP
- Naamiointi: EI MITÄÄN
Aseet ja interventiot
Osallistujaryhmä / Arm |
Interventio / Hoito |
|---|---|
|
KOKEELLISTA: Nenäpolyypit aiheet
24 tutkittavaa, joilla on nenäpolyyppeja.
Interventio: Jokainen koehenkilö saa Nasonexia (mometasonifuroaattia) 2 suihketta sieraimeen kahdesti päivässä 4 viikon ajan.
|
2 suihketta / sieraimeen BID
Muut nimet:
|
Mitä tutkimuksessa mitataan?
Ensisijaiset tulostoimenpiteet
Tulosmittaus |
Toimenpiteen kuvaus |
Aikaikkuna |
|---|---|---|
|
Muutos steroidiherkkyydessä in vivo -oirepisteissä – ongelmia hajuaistin kanssa
Aikaikkuna: Muutos hoitoa edeltävien ja jälkeisten oireiden välillä 4 viikon hoidon jälkeen
|
Arvioida steroidiherkkyyttä koehenkilöillä vertaamalla Trouble ja hajuaistin oireiden pisteitä ennen ja jälkeen 4 viikon mometasonifuroaattinenäsumutehoidon (MFNS).
Hajuaistihäiriöt mitattuna asteikolla 0-4 (0 = ei hajuhäiriöitä; 4 = vakava hajuhäiriö).
Tuloksena on ero keskipistemäärässä (Post - Pre).
Negatiivinen ero osoittaisi, että potilailla oli vähemmän hajuaistin ongelmia tutkimuksen lopussa.
|
Muutos hoitoa edeltävien ja jälkeisten oireiden välillä 4 viikon hoidon jälkeen
|
|
Muutos steroidiherkkyydessä in vivo nenän endoskopiapolyyppipisteissä
Aikaikkuna: Muutos hoitoa edeltävien ja jälkeisten oireiden välillä 4 viikon hoidon jälkeen
|
Arvioida steroidiherkkyyttä koehenkilöillä vertaamalla nenän endoskopian polyyppipisteitä ennen ja jälkeen 4 viikon mometasonifuroaattinenäsumutehoidon (MFNS).
Nenän endoskooppinen polyyppipistemäärä mitattuna asteikolla 0-4 (0 = ei nenäpolyyppiä; 1 = polyyppi keskihaarassa, ei keskiturbinaatin (MT) alareunan alapuolella; 2 = polyyppi MT:n alareunan alapuolella, mutta ei koskettaa alempaa turbinaattia (IT); 3 = polyyppi MT:n alareunan alapuolella ja koskettaa IT:tä; 4 = polyyppi IT:n alarajalla tai sen alapuolella).
Tuloksena on ero keskipistemäärässä (Post - Pre).
Negatiivinen ero osoittaisi, että potilaiden nenäpolyyppien koko pieneni tutkimuksen lopussa.
|
Muutos hoitoa edeltävien ja jälkeisten oireiden välillä 4 viikon hoidon jälkeen
|
Yhteistyökumppanit ja tutkijat
Sponsori
Tutkijat
- Päätutkija: Daniel Hamilos, MD, Mass. General Hospital
Opintojen ennätyspäivät
Opi tärkeimmät päivämäärät
Opiskelun aloitus
Ensisijainen valmistuminen (TODELLINEN)
Opintojen valmistuminen (TODELLINEN)
Opintoihin ilmoittautumispäivät
Ensimmäinen lähetetty
Ensimmäinen toimitettu, joka täytti QC-kriteerit
Ensimmäinen Lähetetty (ARVIO)
Tutkimustietojen päivitykset
Viimeisin päivitys julkaistu (TODELLINEN)
Viimeisin lähetetty päivitys, joka täytti QC-kriteerit
Viimeksi vahvistettu
Lisää tietoa
Tähän tutkimukseen liittyvät termit
Avainsanat
Muita asiaankuuluvia MeSH-ehtoja
Muut tutkimustunnusnumerot
- 2012P000387
Nämä tiedot haettiin suoraan verkkosivustolta clinicaltrials.gov ilman muutoksia. Jos sinulla on pyyntöjä muuttaa, poistaa tai päivittää tutkimustietojasi, ota yhteyttä register@clinicaltrials.gov. Heti kun muutos on otettu käyttöön osoitteessa clinicaltrials.gov, se päivitetään automaattisesti myös verkkosivustollemme .