En öppen studie för att identifiera molekylära markörer för steroidresistens (MERK2)

Besök 1: Baslinjeutvärdering och nasal endoskopi

Vid detta besök kommer varje försöksperson att underteckna ett informerat samtycke, försökspersonens behörighet för studien kommer att bekräftas, en medicinsk historia kommer att erhållas, försökspersonen kommer att genomgå en fysisk undersökning och nasal endoskopi. Ett uringraviditetstest kommer att utföras på alla kvinnor i fertil ålder. NP-storlek kommer att registreras med hjälp av NP-poängsystemet (se nedan).

Allergi hudtest kommer endast att utföras om det inte har gjorts under de senaste 3 åren.

Besök 2: Förbehandlingsbiopsier av näspolyp (NP).

Vid detta besök kommer varje patient att genomgå NP-biopsier före behandling. Biopsierna kommer att erhållas av Dr. Eric Holbrook vid Massachusetts Eye & Ear Infirmary, som ligger intill MGH.

Besök 3: Inledande av behandling med MFNS

Vid detta besök kommer varje försöksperson att genomgå en nässpekulumundersökning för att bekräfta att det inte finns någon kvarvarande blödning från NP-biopsierna. Därefter kommer försökspersonen att ges MFNS (Nasonex ®) i 4 veckor och instrueras att ta 2 sprayer/näsborre BID. Försökspersonerna kommer att få en NP-symtomdagbok och instrueras att registrera NP-symtom dagligen i 4 veckor.

Varje försöksperson kommer att tilldelas ett unikt nummer (screening- eller baslinjenummer) i identifieringssyfte. Under inga omständigheter kommer en patient att tilldelas mer än ett tilldelningsnummer. Nasonex-flaskorna kommer att dispenseras från MGH Research Pharmacy.

Besök 4: NP-biopsi under behandling

Vid detta besök kommer varje patient att genomgå NP-biopsier under behandling. Biopsierna kommer att erhållas av Dr. Eric Holbrook vid Massachusetts Eye & Ear Infirmary, som ligger intill MGH. Patienten kommer att bli ombedd att avbryta behandlingen med Nasonex i 48 timmar efter denna biopsi.

Besök 5: Undersökning efter biopsi Vid detta besök kommer varje försöksperson att genomgå en nässpekulumundersökning för att bekräfta att det inte finns någon kvarvarande blödning från NP-biopsierna. Om blödningen har upphört kommer patienten att återuppta behandlingen med Nasonex.

Besök 5 6: Slutbesök och nasal endoskopi

Vid detta besök kommer varje försöksperson att lämna tillbaka sina använda och oanvända flaskor med Nasonex och skicka in sin NP-symptomdagbok och genomgå en nasal endoskopi. NP-storlek kommer att registreras med hjälp av NP-poängsystemet (se nedan). Försökspersoner kommer också att slutföra en global bedömning av effektiviteten av MFNS för sina NP-symtom.

EXPERIMENTELLA PROCEDURER:

Pre-biopsier explantation kulturer: vi kommer att erhålla NP biopsier för in vitro explantation kultur före steroidbehandling från varje patient. Vi kommer att odla explantaten i MF vid 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M och analysera inflammatoriskt cellinfiltrat och steroidkänslighet baserat på induktion av apoptos (aktiverat caspas-3-uttryck) i inflammatoriska cellundergrupper, alfasläta muskelcellsaktin+ myofibroblaster och epitelceller. Varje tillstånd kommer att utföras i duplikat så att ett prov kan bearbetas för IHC och ett för mikroarray.

Explantationskulturer: NP-explantat kommer att odlas i minimalt essentiellt medium i 24 timmar vid 37oC med plattbottnade vävnadsodlingsplattor. Efter 24 timmar i odling kommer 1 explantat per tillstånd att bearbetas för IHC och 1 för mikroarray. Vi kommer också att spara kultursupernatant från varje explantattillstånd för bekräftelse av viktiga skillnader i proteinproduktion, baserat på data från IHC och mikroarrayer.

Immunhistokemi (IHC) och konfokal laserimmunfluorescensmikroskopi (CLM): Frysta NP-prover från SS-NP- och SR-NP-patienter före och efter MFNS-behandling kommer att analyseras med immunfluorescenskonfokal lasermikroskopi (IF-CLM) för T-lymfocyter (CD3 och CD4) ), MBP+ eosinofiler, alfa-slät muskelaktin (markör för aktiverade myofibroblaster, monoklonala, R&D Systems, Inc.) och kluvet kaspas-3 (polyklonalt, CST, Beverly, MA). Antalet inflammatoriska celler av varje typ och kluvna kaspas-3-positiva och negativa celler av varje typ kommer att räknas av två observatörer som är blinda för behandling och insamlingsordning. En liknande kvantifiering av epitelfärgning för PCNA (en markör för epitelcellsproliferation) och klyvd kaspas-3 kommer att utföras med semikvantitativ gradering av omfattning och intensitet av färgning som i våra tidigare studier. Intensiteten och fördelningen av immunfärgning kommer att kvantifieras på en semikvantitativ graderingsskala av: 0 = frånvarande färgning, 1 = mild diffus eller måttlig fläckig färgning; 2 = måttlig diffus färgning; 3 = intensiv diffus färgning i epitel, stroma och körtlar av 2 oberoende observatörer.

Histologisk steroidkänslig och steroidresistent fenotypbeteckning: Beteckning av NP-patienter som histologiskt "steroidkänsliga" eller "steroidresistenta" kommer att baseras på följande åtgärder före och 1 vecka efter behandling med MFNS:

1. graden av minskning av NP-eosinofiler förbättring av NP-inflammation,
2. graden av induktion av apoptos i eosinofiler, T-lymfocyter och epitelceller,
3. graden av undertryckande av inflammatoriskt genuttryck baserat på mikroarrayanalys.

Försökspersonerna kommer att rangordnas från mest känsliga till minst känsliga för behandling. Linjär regression kommer att användas för att undersöka korrelationer mellan dessa oberoende kontinuerliga variabler.

Mikroarrayanalys: mikroarrayanalys kommer att användas för att bedöma globalt gen-mRNA-uttryck och även fånga information om pro- och anti-apoptotisk genuttryck i "steroidkänsliga" (SS-NP) och "steroidresistenta" SR-NP-biopsier erhållna före och 1 vecka efter behandling med intranasal mometasonfuroat (MFNS). RNA-isolering för mikroarray görs med hjälp av Arcturus picopure RNA-isoleringssystem. LCM-uppsamlingslock av plast inkuberas vid 42oC i 30 minuter i 25 mikroliter av satsens GITC-innehållande extraktionsbuffert, centrifugeras kort för att samla upp den extraherade lösningen, fryses sedan vid -80oC. Prover tinas och slås samman före rening på pikopure RNA-kolonner, och genomiskt DNA avlägsnas via RNAse-fritt DNAs (Qiagen, Hilden, GmbH) digestion på kolonnerna. Totalt cellulärt RNA från varje kolonn elueras i 11 mikroliter elueringsbuffert och används för beredning av RNA-Seq-biblioteket, eller omvandlas till cDNA-för QRTPCR-analysen, med en total reaktionsvolym på 20 mikroliter via standard superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) protokoll. Vi har också mikroarraydata från 8 friska kontrollmellanturbinater som erhållits i en tidigare studie som kommer att användas för jämförelse av genuttryck med näspolyper.

RNA kommer att renas från en NP-biopsi per patient med ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) som inkluderar ScriptGuard™ RNase Inhibitor för att bibehålla integriteten hos renat RNA. Renad RNA-kvalitet kommer att kontrolleras med RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). Den nedre gränsen för känslighet är 200 pg/ml, vilket gör att vi kan verifiera kvaliteten på RNA extraherat från cirka 1250 celler.

QRTPCR: Gener som uttrycks differentiellt genom RNA-expressionsprofilering kommer att undersökas ytterligare genom kvantitativ realtids-RT-PCR från ett separat litet prov av renat RNA från varje vävnadsfack. RT-PCR kommer att utföras med hjälp av Multiplex MX3000P kvantitativa RT-PCR-system (Stratagene, La Jolla, CA). Baslinjegenexpression kommer att kvantifieras med QRTPCR i förhållande till GAPDH med hjälp av delta-delta Ct (2-∆∆) metoden. Forward och reverse primers kommer att väljas baserat på primerbank programvara (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). För att bekräfta genuttryck i vävnader kommer vi att använda immunhistokemi som i tidigare studier.