Eine Open-Label-Studie zur Identifizierung molekularer Marker der Steroidresistenz (MERK2)

Visite 1: Baseline-Bewertung und nasale Endoskopie

Bei diesem Besuch wird jeder Proband eine Einverständniserklärung unterzeichnen, die Eignung des Probanden für die Studie wird bestätigt, eine Krankengeschichte wird erhoben, der Proband wird einer körperlichen Untersuchung und einer Nasenendoskopie unterzogen. Bei allen Frauen im gebärfähigen Alter wird ein Urin-Schwangerschaftstest durchgeführt. Die NP-Größe wird mit dem NP-Scoring-System (siehe unten) erfasst.

Ein Allergie-Hauttest wird nur durchgeführt, wenn er nicht in den letzten 3 Jahren durchgeführt wurde.

Visite 2: Nasenpolypen (NP)-Biopsien vor der Behandlung

Bei diesem Besuch wird jedes Subjekt den NP-Biopsien vor der Behandlung unterzogen. Die Biopsien werden von Dr. Eric Holbrook in der Massachusetts Eye & Ear Infirmary neben dem MGH entnommen.

Visite 3: Beginn der Behandlung mit MFNS

Bei diesem Besuch wird jeder Proband einer Nasenspekulumuntersuchung unterzogen, um zu bestätigen, dass keine Restblutungen aus den NP-Biopsien vorhanden sind. Dann erhält die Person eine 4-wöchige Versorgung mit MFNS (Nasonex ® ) und wird angewiesen, 2 Sprühstöße/Nasenloch BID zu nehmen. Die Probanden erhalten ein NP-Symptomtagebuch und werden angewiesen, NP-Symptome 4 Wochen lang täglich aufzuzeichnen.

Jedem Probanden wird zu Identifikationszwecken eine eindeutige Nummer (Screening- oder Baseline-Nummer) zugewiesen. Unter keinen Umständen wird einem Patienten mehr als eine Zuordnungsnummer zugeteilt. Die Nasonex-Flaschen werden von der MGH Research Pharmacy ausgegeben.

Visite 4: NP-Biopsie während der Behandlung

Bei diesem Besuch wird jedes Subjekt den NP-Biopsien während der Behandlung unterzogen. Die Biopsien werden von Dr. Eric Holbrook in der Massachusetts Eye & Ear Infirmary neben dem MGH entnommen. Der Proband wird gebeten, die Behandlung mit Nasonex nach dieser Biopsie 48 Stunden lang auszusetzen.

Visite 5: Untersuchung nach der Biopsie Bei dieser Visite wird jeder Proband mit einem Nasenspekulum untersucht, um zu bestätigen, dass es keine Restblutungen aus den NP-Biopsien gibt. Wenn die Blutung aufgehört hat, nimmt die Person die Nasonex-Behandlung wieder auf.

Besuch 5 6: Letzter Besuch und nasale Endoskopie

Bei diesem Besuch gibt jeder Proband seine gebrauchten und unbenutzten Nasonex-Flaschen zurück, reicht sein NP-Symptomtagebuch ein und unterzieht sich einer nasalen Endoskopie. Die NP-Größe wird mit dem NP-Scoring-System (siehe unten) erfasst. Die Probanden werden auch eine globale Bewertung der Wirksamkeit von MFNS für ihre NP-Symptome durchführen.

EXPERIMENTELLE VERFAHREN:

Explantationskulturen vor der Biopsie: Wir erhalten NP-Biopsien für die In-vitro-Explantationskultur vor der Steroidbehandlung von jedem Patienten. Wir werden die Explantate in MF bei 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M kultivieren und das Infiltrat von Entzündungszellen und die Steroidempfindlichkeit basierend auf der Induktion von Apoptose (aktivierte Caspase-3-Expression) in analysieren Untergruppen von Entzündungszellen, alpha-glatte Muskelzellen Aktin+ Myofibroblasten und Epithelzellen. Jede Bedingung wird doppelt durchgeführt, sodass eine Probe für IHC und eine für Microarray verarbeitet werden kann.

Explantatkulturen: NP-Explantate werden in essentiellem Minimalmedium für 24 Stunden bei 37 °C unter Verwendung von Gewebekulturplatten mit flachem Boden kultiviert. Nach 24 Stunden in Kultur wird 1 Explantat pro Zustand für IHC und 1 für Microarray verarbeitet. Wir werden auch Kulturüberstände von jedem Explantatzustand aufbewahren, um wichtige Unterschiede in der Proteinproduktion zu bestätigen, basierend auf Daten von IHC und Microarrays.

Immunhistochemie (IHC) und konfokale Laser-Immunfluoreszenzmikroskopie (CLM): Gefrorene NP-Proben von SS-NP- und SR-NP-Patienten vor und nach der MFNS-Behandlung werden durch konfokale Immunfluoreszenz-Lasermikroskopie (IF-CLM) auf T-Lymphozyten (CD3 und CD4) analysiert ), MBP+ Eosinophile, alpha-glattes Muskelaktin (Marker für aktivierte Myofibroblasten, monoklonal, R & D Systems, Inc.) und gespaltene Caspase-3 (polyklonal, CST, Beverly, MA). Die Anzahl der Entzündungszellen jedes Typs und der gespaltenen Caspase-3-positiven und -negativen Zellen jedes Typs wird von zwei Beobachtern gezählt, die gegenüber der Behandlung und der Reihenfolge der Entnahme blind sind. Eine ähnliche Quantifizierung der Epithelfärbung für PCNA (ein Marker für die Proliferation von Epithelzellen) und gespaltene Caspase-3 wird unter Verwendung einer halbquantitativen Einstufung des Ausmaßes und der Intensität der Färbung wie in unseren früheren Studien durchgeführt. Die Intensität und Verteilung der Immunfärbung wird anhand einer halbquantitativen Bewertungsskala quantifiziert: 0 = keine Färbung, 1 = leichte diffuse oder mäßige fleckige Färbung; 2 = mäßige diffuse Färbung; 3 = intensive diffuse Färbung in Epithel, Stroma und Drüsen durch 2 unabhängige Beobachter.

Histologische Bezeichnung des steroidsensitiven und steroidresistenten Phänotyps: Die Bezeichnung von NP-Patienten als histologisch „steroidsensitiv“ oder „steroidresistent“ basiert auf den folgenden Maßnahmen vor und 1 Woche nach der Behandlung mit MFNS:

1. Ausmaß der Reduktion der NP-Eosinophilen Verbesserung der NP-Entzündung,
2. Ausmaß der Apoptoseinduktion in Eosinophilen, T-Lymphozyten und Epithelzellen,
3. Ausmaß der Unterdrückung der entzündlichen Genexpression basierend auf Microarray-Analyse.

Die Probanden werden in der Reihenfolge von der empfindlichsten bis zur am wenigsten empfindlichen Behandlung eingestuft. Lineare Regression wird verwendet, um Korrelationen zwischen diesen unabhängigen kontinuierlichen Variablen zu untersuchen.

Microarray-Analyse: Die Microarray-Analyse wird verwendet, um die globale Gen-mRNA-Expression zu bewerten und auch Informationen über die pro- und antiapoptotische Genexpression in „Steroid-empfindlichen“ (SS-NP) und „Steroid-resistenten“ SR-NP-Biopsien zu erfassen, die vor und 1 erhalten wurden Woche nach der Behandlung mit intranasalem Mometasonfuroat (MFNS). Die RNA-Isolierung für Microarrays erfolgt mit dem Arcturus picopure RNA-Isolierungssystem. Kunststoff-LCM-Sammelkappen werden bei 42 °C für 30 Minuten in 25 Mikroliter des GITC-haltigen Extraktionspuffers des Kits inkubiert, kurz zentrifugiert, um die extrahierte Lösung zu sammeln, und dann bei -80 °C eingefroren. Die Proben werden aufgetaut und vor der Reinigung auf Picopure-RNA-Säulen gepoolt, und genomische DNA wird durch RNAse-freie DNAse-Verdauung (Qiagen, Hilden, GmbH) auf den Säulen entfernt. Die gesamten zellulären RNAs aus jeder Säule werden in 11 Mikroliter Elutionspuffer eluiert und zur Herstellung der RNA-Seq-Bibliothek verwendet oder für den QRTPCR-Assay in cDNA umgewandelt, wobei ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern über den hochgestellten Standard-III (Invitrogen, Carlsbad, CA)-Protokoll. Wir haben auch Microarray-Daten von 8 gesunden mittleren Muscheln zur Kontrolle, die in einer früheren Studie erhalten wurden, die zum Vergleich der Genexpression mit Nasenpolypen verwendet werden.

RNA wird aus einer NP-Biopsie pro Patient mit dem ArrayPure™ Nano-Scale RNA Purification Kit (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) gereinigt, das ScriptGuard™ RNase-Inhibitor enthält, um die Integrität der gereinigten RNA zu erhalten. Die Qualität der gereinigten RNA wird mithilfe der RNA-Nanoanalyse (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA) überprüft. Die untere Empfindlichkeitsgrenze liegt bei 200 pg/ml, wodurch wir die Qualität der aus etwa 1250 Zellen extrahierten RNA überprüfen können.

QRTPCR: Gene, die durch RNA-Expressionsprofilierung differentiell exprimiert werden, werden durch quantitative Echtzeit-RT-PCR aus einer separaten kleinen Probe gereinigter RNA aus jedem Gewebekompartiment weiter untersucht. RT-PCR wird unter Verwendung des quantitativen RT-PCR-Systems Multiplex MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA) durchgeführt. Die Baseline-Genexpression wird durch QRTPCR relativ zu GAPDH unter Verwendung der Delta-Delta-Ct (2-∆∆)-Methode quantifiziert. Forward- und Reverse-Primer werden basierend auf der Primerbank-Software (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) ausgewählt. Um die Genexpression innerhalb von Geweben zu bestätigen, werden wir wie in früheren Studien Immunhistochemie verwenden.