Une étude ouverte pour identifier les marqueurs moléculaires de la résistance aux stéroïdes (MERK2)

Visite 1 : Évaluation de base et endoscopie nasale

Lors de cette visite, chaque sujet signera un consentement éclairé, l'éligibilité du sujet à l'étude sera confirmée, des antécédents médicaux seront obtenus, le sujet subira un examen physique et une endoscopie nasale. Un test de grossesse urinaire sera effectué sur toutes les femmes en âge de procréer. La taille NP sera enregistrée à l'aide du système de notation NP (voir ci-dessous).

Les tests cutanés d'allergie ne seront effectués que s'ils n'ont pas été effectués au cours des 3 dernières années.

Visite 2 : biopsies de polypes nasaux (NP) avant le traitement

Lors de cette visite, chaque sujet subira les biopsies NP de prétraitement. Les biopsies seront obtenues par le Dr Eric Holbrook au Massachusetts Eye & Ear Infirmary, situé à côté du MGH.

Visite 3 : Initiation du traitement avec MFNS

Lors de cette visite, chaque sujet subira un examen au spéculum nasal pour confirmer qu'il n'y a pas de saignement résiduel des biopsies NP. Ensuite, le sujet recevra un approvisionnement de 4 semaines de MFNS (Nasonex®) et sera chargé de prendre 2 pulvérisations/narine BID. Les sujets recevront un journal des symptômes NP et seront chargés d'enregistrer les symptômes NP quotidiennement pendant 4 semaines.

Chaque sujet se verra attribuer un numéro unique (numéro de dépistage ou de référence) à des fins d'identification. En aucun cas, un patient ne se verra attribuer plus d'un numéro d'attribution. Les flacons de Nasonex seront délivrés par la Pharmacie de Recherche de l'HGM.

Visite 4 : Biopsie NP pendant le traitement

Lors de cette visite, chaque sujet subira les biopsies NP en cours de traitement. Les biopsies seront obtenues par le Dr Eric Holbrook au Massachusetts Eye & Ear Infirmary, situé à côté du MGH. Il sera demandé au sujet de suspendre le traitement Nasonex pendant 48 heures après cette biopsie.

Visite 5 : Examen post-biopsie Lors de cette visite, chaque sujet subira un examen au spéculum nasal pour confirmer qu'il n'y a pas de saignement résiduel des biopsies NP. Si le saignement a cessé, le sujet reprendra le traitement par Nasonex.

Visite 5 6 : Visite finale et endoscopie nasale

Lors de cette visite, chaque sujet retournera ses flacons de Nasonex utilisés et non utilisés, soumettra son journal des symptômes NP et subira une endoscopie nasale. La taille NP sera enregistrée à l'aide du système de notation NP (voir ci-dessous). Les sujets effectueront également une évaluation globale de l'efficacité de la MFNS pour leurs symptômes de NP.

PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES:

Cultures d'explants pré-biopsies : nous obtiendrons des biopsies NP pour la culture d'explants in vitro avant le traitement stéroïdien de chaque patient. Nous cultiverons les explants en MF à 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M et analyserons l'infiltrat cellulaire inflammatoire et la sensibilité aux stéroïdes en fonction de l'induction de l'apoptose (expression de la caspase-3 activée) dans sous-ensembles de cellules inflammatoires, actine des cellules musculaires lisses alpha + myofibroblastes et cellules épithéliales. Chaque condition sera effectuée en double afin qu'un échantillon puisse être traité pour l'IHC et un pour le microréseau.

Cultures d'explants : les explants de NP seront cultivés dans un milieu essentiel minimal pendant 24 heures à 37 oC à l'aide de plaques de culture tissulaire à fond plat. Après 24 heures de culture, 1 explant par condition sera traité pour IHC et 1 pour microarray. Nous conserverons également le surnageant de culture de chaque condition d'explantation pour confirmer les différences importantes dans la production de protéines, sur la base des données de l'IHC et des microréseaux.

Immunohistochimie (IHC) et microscopie confocale à immunofluorescence laser (CLM) : des échantillons congelés de NP provenant de patients SS-NP et SR-NP avant et après le traitement par MFNS seront analysés par microscopie laser confocale à immunofluorescence (IF-CLM) pour les lymphocytes T (CD3 et CD4 ), les éosinophiles MBP+, l'actine alpha-musculaire lisse (marqueur des myofibroblastes activés, monoclonal, R&D Systems, Inc.) et la caspase-3 clivée (polyclonale, CST, Beverly, MA). Le nombre de cellules inflammatoires de chaque type et de cellules positives et négatives pour la caspase-3 clivées de chaque type sera compté par deux observateurs ignorant le traitement et l'ordre de prélèvement. Une quantification similaire de la coloration épithéliale pour PCNA (un marqueur de la prolifération des cellules épithéliales) et de la caspase-3 clivée sera effectuée en utilisant un classement semi-quantitatif de l'étendue et de l'intensité de la coloration comme dans nos études précédentes. L'intensité et la distribution de l'immunocoloration seront quantifiées sur une échelle de notation semi-quantitative de : 0 = coloration absente, 1 = coloration diffuse légère ou modérée par taches ; 2 = coloration diffuse modérée ; 3 = coloration diffuse intense dans l'épithélium, le stroma et les glandes par 2 observateurs indépendants.

Désignation histologique du phénotype sensible aux stéroïdes et résistant aux stéroïdes : la désignation des sujets NP comme histologiquement « sensibles aux stéroïdes » ou « résistants aux stéroïdes » sera basée sur les mesures suivantes avant et 1 semaine après le traitement par MFNS :

1. degré de réduction des éosinophiles NP amélioration de l'inflammation NP,
2. degré d'induction de l'apoptose chez les éosinophiles, les lymphocytes T et les cellules épithéliales,
3. mesure de la suppression de l'expression des gènes inflammatoires basée sur l'analyse des microréseaux.

Les sujets seront classés du plus sensible au moins sensible au traitement. La régression linéaire sera utilisée pour examiner les corrélations entre ces variables continues indépendantes.

Analyse par microréseau : l'analyse par microréseau sera utilisée pour évaluer l'expression globale de l'ARNm des gènes et également pour capturer des informations sur l'expression des gènes pro- et anti-apoptotique dans les biopsies SR-NP "sensibles aux stéroïdes" (SS-NP) et "résistantes aux stéroïdes" obtenues avant et 1 semaine suivant le traitement par le furoate de mométasone intranasal (MFNS). L'isolement d'ARN pour microréseau est effectué à l'aide du système d'isolement d'ARN picopure Arcturus. Les bouchons collecteurs en plastique LCM sont incubés à 42°C pendant 30 minutes dans 25 microlitres de tampon d'extraction contenant du GITC du kit, centrifugés brièvement pour recueillir la solution extraite, puis congelés à -80°C. Les échantillons sont décongelés et regroupés avant la purification sur des colonnes d'ARN picopure, et l'ADN génomique est éliminé par digestion avec une ADNase sans ARNase (Qiagen, Hilden, GmbH) sur les colonnes. Les ARN cellulaires totaux de chaque colonne sont élués dans 11 microlitres de tampon d'élution et utilisés pour la préparation de la bibliothèque RNA-Seq, ou convertis en ADNc pour le test QRTPCR, en utilisant un volume de réaction total de 20 microlitres via l'exposant standard III (Invitrogen, Carlsbad, Californie). Nous avons également des données de microréseau de 8 cornets moyens témoins sains obtenus dans une étude précédente qui seront utilisées pour comparer l'expression des gènes aux polypes nasaux.

L'ARN sera purifié à partir d'une biopsie NP par patient à l'aide du kit de purification d'ARN à l'échelle nanométrique ArrayPure™ (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) qui comprend l'inhibiteur de RNase ScriptGuard™ pour maintenir l'intégrité de l'ARN purifié. La qualité de l'ARN purifié sera vérifiée à l'aide de l'analyse RNA Nano (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). La limite inférieure de sensibilité est de 200 pg/ml, nous permettant de vérifier la qualité de l'ARN extrait d'environ 1250 cellules.

QRTPCR : les gènes exprimés de manière différentielle par le profilage de l'expression de l'ARN seront étudiés plus en détail par RT-PCR quantitative en temps réel à partir d'un petit échantillon séparé d'ARN purifié de chaque compartiment tissulaire. La RT-PCR sera réalisée à l'aide du système de RT-PCR quantitative Multiplex MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA). L'expression génique de base sera quantifiée par QRTPCR par rapport à GAPDH en utilisant la méthode delta-delta Ct (2-∆∆). Les amorces directes et inverses seront sélectionnées en fonction du logiciel Primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Pour confirmer l'expression des gènes dans les tissus, nous utiliserons l'immunohistochimie comme dans les études précédentes.