Um estudo aberto para identificar marcadores moleculares de resistência a esteróides (MERK2)

Visita 1: avaliação inicial e endoscopia nasal

Nesta visita, cada sujeito assinará um consentimento informado, a elegibilidade do sujeito para o estudo será confirmada, um histórico médico será obtido, o sujeito será submetido a um exame físico e endoscopia nasal. Um teste de gravidez de urina será realizado em todas as mulheres com potencial para engravidar. O tamanho do NP será registrado usando o sistema de pontuação do NP (veja abaixo).

O teste cutâneo de alergia só será realizado se não tiver sido feito nos últimos 3 anos.

Visita 2: Biópsias de pólipos nasais (NP) pré-tratamento

Nesta visita, cada sujeito será submetido às biópsias NP pré-tratamento. As biópsias serão obtidas pelo Dr. Eric Holbrook no Massachusetts Eye & Ear Infirmary, localizado ao lado do MGH.

Visita 3: Início do tratamento com MFNS

Nesta visita, cada indivíduo terá um exame de espéculo nasal para confirmar que não há sangramento residual das biópsias NP. Em seguida, o sujeito receberá um suprimento de 4 semanas de MFNS (Nasonex ®) e será instruído a tomar 2 sprays/narina BID. Os indivíduos receberão um diário de sintomas de NP e serão instruídos a registrar os sintomas de NP diariamente por 4 semanas.

Cada sujeito receberá um número exclusivo (triagem ou número de linha de base) para fins de identificação. Sob nenhuma circunstância um paciente receberá mais de um número de alocação. Os frascos de Nasonex serão fornecidos pela MGH Research Pharmacy.

Visita 4: Biópsia de NP durante o tratamento

Nesta visita, cada sujeito será submetido às biópsias NP durante o tratamento. As biópsias serão obtidas pelo Dr. Eric Holbrook no Massachusetts Eye & Ear Infirmary, localizado ao lado do MGH. O sujeito será solicitado a suspender o tratamento com Nasonex por 48 horas após esta biópsia.

Visita 5: Exame pós-biópsia Nesta visita, cada indivíduo fará um exame de espéculo nasal para confirmar que não há sangramento residual das biópsias NP. Se o sangramento tiver cessado, o paciente retomará o tratamento com Nasonex.

Visita 5 6: visita final e endoscopia nasal

Nesta visita, cada sujeito devolverá seus frascos de Nasonex usados ​​e não utilizados e enviará seu diário de sintomas de NP e será submetido a uma endoscopia nasal. O tamanho do NP será registrado usando o sistema de pontuação do NP (veja abaixo). Os indivíduos também completarão uma avaliação global da eficácia do MFNS para seus sintomas de NP.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS:

Culturas de explantes pré-biópsias: obteremos biópsias NP para cultura de explantes in vitro antes do tratamento com esteroides de cada paciente. Cultivaremos os explantes em MF a 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M e analisaremos infiltrado de células inflamatórias e sensibilidade a esteróides com base na indução de apoptose (expressão de caspase-3 ativada) em subconjuntos de células inflamatórias, alfa-células musculares lisas actina + miofibroblastos e células epiteliais. Cada condição será realizada em duplicata para que uma amostra possa ser processada para IHC e outra para microarray.

Culturas de explantes: Os explantes NP serão cultivados em meio essencial mínimo por 24 horas a 37oC usando placas de cultura de tecidos de fundo plano. Após 24 horas de cultura, 1 explante por condição será processado para IHC e 1 para microarray. Também salvaremos o sobrenadante da cultura de cada condição de explante para confirmação de diferenças importantes na produção de proteínas, com base nos dados do IHC e microarrays.

Imuno-histoquímica (IHC) e microscopia confocal de imunofluorescência a laser (CLM): Amostras NP congeladas de pacientes SS-NP e SR-NP antes e depois do tratamento com MFNS serão analisadas por microscopia confocal a laser de imunofluorescência (IF-CLM) para linfócitos T (CD3 e CD4 ), eosinófilos MBP+, alfa-actina de músculo liso (marcador de miofibroblastos ativados, monoclonal, R & D Systems, Inc.) e caspase-3 clivada (policlonal, CST, Beverly, MA). O número de células inflamatórias de cada tipo e células clivadas de caspase-3 positivas e negativas de cada tipo será contado por dois observadores cegados para tratamento e ordem de coleta. Uma quantificação semelhante de coloração epitelial para PCNA (um marcador de proliferação de células epiteliais) e caspase-3 clivada será realizada usando classificação semiquantitativa de extensão e intensidade de coloração como em nossos estudos anteriores. A intensidade e distribuição da imunocoloração serão quantificadas em uma escala semi-quantitativa de: 0 = coloração ausente, 1 = coloração difusa leve ou manchada moderada; 2 = coloração difusa moderada; 3 = intensa coloração difusa no epitélio, estroma e glândulas por 2 observadores independentes.

Designação de fenótipo histológico sensível a esteróides e resistente a esteróides: A designação de indivíduos NP como histologicamente "sensíveis a esteróides" ou "resistentes a esteróides" será baseada nas seguintes medidas antes e 1 semana após o tratamento com MFNS:

1. extensão da redução nos eosinófilos NP melhora na inflamação NP,
2. extensão da indução de apoptose em eosinófilos, linfócitos T e células epiteliais,
3. extensão da supressão da expressão do gene inflamatório com base na análise de microarray.

Os indivíduos serão classificados em ordem do mais sensível ao menos sensível ao tratamento. A regressão linear será usada para examinar as correlações entre essas variáveis ​​contínuas independentes.

Análise de microarray: a análise de microarray será usada para avaliar a expressão global de mRNA do gene e também capturar informações sobre a expressão de genes pró e anti-apoptóticos em biópsias de SR-NP "esteróides sensíveis" (SS-NP) e "esteróides resistentes" obtidas antes e 1 semana após o tratamento com furoato de mometasona intranasal (MFNS). O isolamento de RNA para microarray é feito usando o sistema de isolamento de RNA Arcturus picopure. As tampas plásticas de coleta de LCM são incubadas a 42oC por 30 minutos em 25 microlitros do tampão de extração contendo GITC do kit, centrifugadas brevemente para coletar a solução extraída e depois congeladas a -80oC. As amostras são descongeladas e agrupadas antes da purificação em colunas de RNA picopuro, e o DNA genômico é removido por digestão com DNAse livre de RNAse (Qiagen, Hilden, GmbH) nas colunas. Os RNAs celulares totais de cada coluna são eluídos em 11 microlitros de tampão de eluição e usados ​​para a preparação da biblioteca RNA-Seq, ou convertidos em cDNA para o ensaio QRTPCR, usando um volume total de reação de 20 microlitros por meio do superscript III padrão (Invitrogen, Carlsbad, CA). Também temos dados de microarray de 8 cornetos médios de controle saudáveis ​​obtidos em um estudo anterior que serão usados ​​para comparação da expressão gênica para pólipos nasais.

O RNA será purificado de uma biópsia NP por paciente usando o kit de purificação de RNA em nanoescala ArrayPure™, (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI), que inclui o inibidor de RNase ScriptGuard™ para manter a integridade do RNA purificado. A qualidade do RNA purificado será verificada usando RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). O limite inferior de sensibilidade é de 200 pg/ml, permitindo verificar a qualidade do RNA extraído de cerca de 1250 células.

QRTPCR: Os genes que são diferencialmente expressos por perfis de expressão de RNA serão investigados por RT-PCR quantitativo em tempo real a partir de uma pequena amostra separada de RNA purificado de cada compartimento de tecido. O RT-PCR será realizado usando o sistema Multiplex MX3000P quantitativo RT-PCR (Stratagene, La Jolla, CA). A expressão gênica basal será quantificada por QRTPCR em relação a GAPDH usando o método delta-delta Ct (2-∆∆). Os primers direto e reverso serão selecionados com base no software primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Para confirmar a expressão gênica nos tecidos, usaremos imuno-histoquímica como em estudos anteriores.