Открытое исследование по выявлению молекулярных маркеров устойчивости к стероидам (MERK2)

Визит 1: базовая оценка и назальная эндоскопия

Во время этого визита каждый субъект подпишет информированное согласие, будет подтверждено право субъекта на участие в исследовании, будет получена история болезни, субъект пройдет медицинский осмотр и эндоскопию носа. Тест мочи на беременность будет проводиться у всех женщин детородного возраста. Размер NP будет записан с использованием системы подсчета NP (см. ниже).

Кожные аллергические пробы будут проводиться только в том случае, если они не проводились в течение последних 3 лет.

Визит 2: биопсия полипов носа до лечения

Во время этого визита каждый субъект пройдет предварительную биопсию NP. Биопсии будут получены доктором Эриком Холбруком в Массачусетской офтальмологической и ушной больнице, расположенной рядом с MGH.

Визит 3: Начало лечения МФНС

Во время этого визита каждому субъекту будет проведен осмотр носового зеркала, чтобы подтвердить отсутствие остаточного кровотечения из биопсии NP. Затем субъекту дадут 4-недельный запас MFNS (Nasonex®) и проинструктируют принимать по 2 впрыскивания в ноздрю два раза в день. Субъектам дадут дневник симптомов НП и проинструктируют ежедневно записывать симптомы НП в течение 4 недель.

Каждому субъекту будет присвоен уникальный номер (скрининговый или базовый номер) для целей идентификации. Ни при каких обстоятельствах пациенту не будет присвоено более одного номера присвоения. Флаконы Nasonex будут продаваться в исследовательской аптеке MGH.

Визит 4: биопсия НП во время лечения

Во время этого визита каждый субъект пройдет биопсию NP во время лечения. Биопсии будут получены доктором Эриком Холбруком в Массачусетской офтальмологической и ушной больнице, расположенной рядом с MGH. Субъекту будет предложено воздержаться от лечения Назонексом в течение 48 часов после этой биопсии.

Визит 5: Осмотр после биопсии. Во время этого визита каждый субъект будет обследован с помощью носового зеркала, чтобы убедиться в отсутствии остаточного кровотечения из биоптатов NP. Если кровотечение прекратилось, субъект возобновит лечение Назонексом.

Визит 5 6: Заключительный визит и назальная эндоскопия

Во время этого визита каждый субъект вернет свои использованные и неиспользованные флаконы с назонексом, представит свой дневник симптомов НБ и пройдет назальную эндоскопию. Размер NP будет записан с использованием системы подсчета NP (см. ниже). Субъекты также завершат глобальную оценку эффективности MFNS для их симптомов NP.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ:

Культуры эксплантов перед биопсией: мы будем получать биоптаты NP для культуры эксплантатов in vitro до лечения стероидами у каждого пациента. Мы будем культивировать эксплантаты в MF при 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M и анализировать воспалительный клеточный инфильтрат и чувствительность к стероидам на основе индукции апоптоза (экспрессия активированной каспазы-3) в подгруппы воспалительных клеток, альфа-гладкомышечные клетки, актин + миофибробласты и эпителиальные клетки. Каждое условие будет выполняться в двух экземплярах, чтобы можно было обработать один образец для IHC и один для микрочипа.

Культуры эксплантатов: эксплантаты NP будут культивироваться в минимальной основной среде в течение 24 часов при 37oC с использованием планшетов для культивирования тканей с плоским дном. После 24 часов культивирования по 1 эксплантату в каждом состоянии будут обрабатываться для IHC и 1 для микрочипа. Мы также сохраним культуральный супернатант из каждого состояния эксплантата для подтверждения важных различий в производстве белка на основе данных IHC и микрочипов.

Иммуногистохимия (IHC) и конфокальная лазерная иммунофлуоресцентная микроскопия (CLM): замороженные образцы NP от пациентов с SS-NP и SR-NP до и после лечения MFNS будут проанализированы с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной лазерной микроскопии (IF-CLM) на Т-лимфоциты (CD3 и CD4). ), MBP+ эозинофилы, альфа-гладкомышечный актин (маркер активированных миофибробластов, моноклональный, R&D Systems, Inc.) и расщепленную каспазу-3 (поликлональный, CST, Beverly, MA). Количество воспалительных клеток каждого типа и расщепленных каспаз-3 положительных и отрицательных клеток каждого типа подсчитывают два наблюдателя, не осведомленные о лечении и порядке сбора. Аналогичная количественная оценка эпителиального окрашивания для PCNA (маркер пролиферации эпителиальных клеток) и расщепленной каспазы-3 будет проводиться с использованием полуколичественной оценки степени и интенсивности окрашивания, как и в наших предыдущих исследованиях. Интенсивность и распределение иммунного окрашивания будут количественно оцениваться по полуколичественной шкале оценки: 0 = отсутствие окрашивания, 1 = легкое диффузное или умеренное пятнистое окрашивание; 2 = умеренное диффузное окрашивание; 3 = интенсивное диффузное окрашивание эпителия, стромы и желез двумя независимыми наблюдателями.

Обозначение гистологического стероидчувствительного и стероидорезистентного фенотипа: Обозначение субъектов с НП как гистологически «стероидочувствительных» или «стероидорезистентных» будет основано на следующих мерах до и через 1 неделю после лечения МФНС:

1. степень уменьшения эозинофилов НП улучшение воспаления НП,
2. степень индукции апоптоза в эозинофилах, Т-лимфоцитах и ​​эпителиальных клетках,
3. степень подавления экспрессии воспалительного гена на основе анализа микрочипов.

Субъекты ранжируются в порядке от наиболее чувствительных к наименее чувствительным к лечению. Линейная регрессия будет использоваться для изучения корреляций между этими независимыми непрерывными переменными.

Анализ микрочипов: анализ микрочипов будет использоваться для оценки глобальной экспрессии мРНК генов, а также для сбора информации об экспрессии про- и антиапоптотических генов в «стероидочувствительных» (SS-NP) и «стероидорезистентных» биопсиях SR-NP, полученных до и 1 неделю после лечения интраназальным мометазона фуроатом (MFNS). Выделение РНК для микрочипов осуществляется с использованием системы выделения РНК Arcturus picopure. Пластиковые колпачки для сбора LCM инкубируют при 42°C в течение 30 минут в 25 мкл буфера для экстракции, содержащего GITC, кратковременно центрифугируют для сбора экстрагированного раствора, затем замораживают при -80°C. Образцы размораживают и объединяют перед очисткой на колонках picopure RNA, а геномную ДНК удаляют с помощью расщепления ДНКазой без РНКазы (Qiagen, Hilden, GmbH) на колонках. Суммарные клеточные РНК из каждой колонки элюируют в 11 мкл элюирующего буфера и используют для приготовления библиотеки RNA-Seq или превращают в кДНК для анализа QRTPCR с использованием общего реакционного объема 20 мкл с помощью стандартного надстрочного индекса III (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) протокол. У нас также есть данные микрочипа от 8 здоровых контрольных средних носовых раковин, полученные в предыдущем исследовании, которые будут использоваться для сравнения экспрессии генов с полипами носа.

РНК будет очищена из одной биопсии NP на пациента с использованием набора для очистки РНК ArrayPure™ Nano-scale (EPICENTRE Biotechnologies, Мэдисон, Висконсин), который включает ингибитор РНКазы ScriptGuard™ для поддержания целостности очищенной РНК. Качество очищенной РНК проверяют с помощью наноанализа РНК (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Фостер-Сити, Калифорния). Нижний предел чувствительности составляет 200 пг/мл, что позволяет нам проверить качество РНК, выделенной примерно из 1250 клеток.

QRTPCR: гены, которые по-разному экспрессируются с помощью профилирования экспрессии РНК, будут дополнительно исследованы с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени из отдельного небольшого образца очищенной РНК из каждого тканевого компартмента. ОТ-ПЦР будет проводиться с использованием системы количественной ОТ-ПЦР Multiplex MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA). Базовая экспрессия генов будет количественно определена с помощью QRTPCR относительно GAPDH с использованием метода дельта-дельта Ct (2-∆∆). Прямые и обратные праймеры будут выбраны на основе программного обеспечения праймербанка (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). Чтобы подтвердить экспрессию генов в тканях, мы будем использовать иммуногистохимию, как и в предыдущих исследованиях.