Nyílt vizsgálat a szteroidrezisztencia molekuláris markereinek azonosítására (MERK2)

1. látogatás: Kiindulási állapot kiértékelése és orr endoszkópia

Ezen a látogatáson minden alany aláír egy tájékozott beleegyező nyilatkozatot, megerősítik az alany vizsgálatra való alkalmasságát, kórelőzményt vesznek fel, az alany fizikális vizsgálaton és orr endoszkópián esik át. Minden fogamzóképes nőnél vizelet terhességi tesztet végeznek. Az NP méretét a rendszer az NP pontozási rendszerrel rögzíti (lásd alább).

Allergiás bőrvizsgálatra csak akkor kerül sor, ha az elmúlt 3 évben nem történt meg.

2. látogatás: Kezelés előtti orrpolip (NP) biopsziák

Ezen a látogatáson minden alany átesik a kezelés előtti NP-biopszián. A biopsziákat Dr. Eric Holbrook veszi a Massachusetts Eye & Ear Infirmary-ben, amely az MGH mellett található.

3. látogatás: Az MFNS-es kezelés megkezdése

Ezen a látogatáson minden alanyon orrspekulum-vizsgálatot végeznek annak igazolására, hogy nincs-e visszamaradt vérzés az NP-biopsziákból. Ezután az alany 4 hetes MFNS-t (Nasonex®) kap, és utasítják, hogy 2 permetet kell bevenni orrlyukonként kétszer. Az alanyok NP-tünetnaplót kapnak, és utasítják őket, hogy 4 héten keresztül naponta rögzítsék az NP-tüneteket.

Minden alany egyedi számot (szűrési vagy alapszámot) kap az azonosítás céljából. Egy pácienshez semmilyen körülmények között nem rendelnek több kiosztási számot. A Nasonex palackokat az MGH Kutatópatika fogja kiadni.

4. látogatás: kezelés közbeni NP biopszia

Ezen a látogatáson minden alany átesik a kezelés közbeni NP-biopszián. A biopsziákat Dr. Eric Holbrook veszi a Massachusetts Eye & Ear Infirmary-ben, amely az MGH mellett található. Az alanynak a biopsziát követő 48 órában fel kell függesztenie a Nasonex-kezelést.

5. látogatás: Biopszia utáni vizsgálat Ezen a látogatáson minden alanyon orrspekulum-vizsgálatot végeznek annak igazolására, hogy nincs-e visszamaradt vérzés az NP-biopsziákból. Ha a vérzés megszűnt, az alany folytatja a Nasonex-kezelést.

5 6. vizit: Utolsó vizit és orr endoszkópia

Ezen a látogatáson minden vizsgálati alany visszaküldi a használt és fel nem használt Nasonex palackokat, benyújtja NP tüneti naplóját, és orr endoszkópián esik át. Az NP méretét a rendszer az NP pontozási rendszerrel rögzíti (lásd alább). Az alanyok az MFNS hatékonyságának globális értékelését is elvégzik NP-tüneteik tekintetében.

KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK:

Biopszia előtti explantációs tenyészetek: minden pácienstől NP biopsziát veszünk az in vitro explantációs tenyészethez a szteroid kezelés előtt. Az explantátumokat MF-ben tenyésztjük 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M, és elemezzük a gyulladásos sejt infiltrátumot és a szteroid érzékenységet az apoptózis indukciója (aktivált kaszpáz-3 expresszió) alapján. gyulladásos sejtek alcsoportjai, alfa-simaizomsejt aktin+ myofibroblasztok és hámsejtek. Mindegyik feltételt kétszer hajtják végre, így egy mintát lehet feldolgozni az IHC-hez, egyet pedig a microarray-hez.

Explantátum tenyészetek: Az NP explantátumokat minimális esszenciális tápközegben tenyésztjük 24 órán keresztül 37 oC-on lapos fenekű szövettenyésztő lemezeken. 24 órás tenyésztést követően állapotonként 1 explantátumot dolgozunk fel IHC-hez és 1-et microarray-hez. A tenyészet felülúszóját is mentjük minden explantációs körülményből, hogy megerősítsük a fehérjetermelésben mutatkozó fontos különbségeket, az IHC és a microarray adatok alapján.

Immunhisztokémia (IHC) és konfokális lézeres immunfluoreszcens mikroszkópia (CLM): Az SS-NP és SR-NP betegek fagyasztott NP mintáit az MFNS kezelés előtt és után immunfluoreszcens konfokális lézermikroszkóppal (IF-CLM) elemzik a T limfocita (CD3 és CD4) kimutatására. ), MBP+ eozinofilek, alfa-simaizom aktin (aktivált myofibroblasztok markere, monoklonális, R&D Systems, Inc.) és hasított kaszpáz-3 (poliklonális, CST, Beverly, MA). Az egyes típusok gyulladásos sejtjeinek, valamint az egyes típusok hasított kaszpáz-3 pozitív és negatív sejtjeinek számát két megfigyelő számolja meg, akik nem látják a kezelést és a gyűjtés sorrendjét. A PCNA (az epiteliális sejtproliferáció markere) és a hasított kaszpáz-3 epiteliális festődésének hasonló mennyiségi meghatározását a festődés mértékének és intenzitásának szemikvantitatív osztályozásával végezzük, mint korábbi tanulmányainkban. Az immunfestődés intenzitását és eloszlását egy félkvantitatív skálán kell számszerűsíteni: 0 = hiányzik a festődés, 1 = enyhe diffúz vagy közepesen foltos festődés; 2 = mérsékelt diffúz festődés; 3 = intenzív diffúz festődés a hámban, a stromában és a mirigyekben 2 független megfigyelő által.

Szövettani szteroid-érzékeny és szteroid-rezisztens fenotípus megjelölés: Az NP-alanyok szövettanilag „szteroid-érzékeny” vagy „szteroid-rezisztens” minősítése a következő intézkedéseken fog alapulni az MFNS-kezelés előtt és egy héttel azután:

1. az NP eozinofilek számának csökkenésének mértéke, javul az NP gyulladása,
2. az apoptózis indukciójának mértéke eozinofilekben, T-limfocitákban és hámsejtekben,
3. a gyulladásos génexpresszió szuppressziójának mértéke microarray elemzés alapján.

Az alanyok sorrendje a kezelésre legérzékenyebbtől a legkevésbé érzékenyig. Lineáris regressziót alkalmazunk a független folytonos változók közötti összefüggések vizsgálatára.

Microarray analízis: microarray analízist használnak a globális gén mRNS expressziójának értékelésére, valamint a pro- és antiapoptotikus génexpresszióra vonatkozó információk rögzítésére "szteroidérzékeny" (SS-NP) és "szteroid rezisztens" SR-NP biopsziákban, amelyeket korábban és 1. héten intranazális mometazon-furoáttal (MFNS) végzett kezelést követően. A microarray RNS-izolálása az Arcturus picopure RNS-izolációs rendszerrel történik. A műanyag LCM gyűjtőkupakokat 42 oC-on 30 percig inkubáljuk a kit 25 mikroliteres GITC tartalmú extrakciós pufferében, röviden centrifugáljuk, hogy összegyűjtsük az extrahált oldatot, majd -80 oC-on lefagyasztjuk. A mintákat felolvasztjuk és összegyűjtjük a pikopure RNS oszlopokon végzett tisztítás előtt, és a genomi DNS-t RNS-mentes DNS-ázzal (Qiagen, Hilden, GmbH) eltávolítjuk az oszlopokon. Az egyes oszlopokból származó összes sejt-RNS-t 11 mikroliter elúciós pufferben eluáljuk, és felhasználjuk az RNA-Seq könyvtár elkészítésére, vagy cDNS-vé alakítjuk a QRTPCR vizsgálathoz, 20 mikroliter teljes reakciótérfogat felhasználásával a standard felső index III-on keresztül (Invitrogen, Carlsbad, CA) protokoll. Egy korábbi tanulmányban nyert 8 egészséges kontroll középső turbinátról is rendelkezünk microarray adatokkal, amelyeket a génexpresszió és az orrpolipok összehasonlítására fogunk használni.

Az RNS-t páciensenként egy NP-biopsziából tisztítják meg az ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) segítségével, amely ScriptGuard™ RNáz inhibitort tartalmaz a tisztított RNS integritásának megőrzése érdekében. A tisztított RNS minőségét az RNA Nano Analysis (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA) segítségével ellenőrizzük. Az alsó határ érzékenység 200 pg/ml, ami lehetővé teszi a körülbelül 1250 sejtből kivont RNS minőségének ellenőrzését.

QRTPCR: Az RNS-expressziós profilozással eltérően expresszálódó géneket kvantitatív valós idejű RT-PCR-rel tovább vizsgáljuk, minden egyes szöveti kompartmentből származó tisztított RNS különálló kis mintájából. Az RT-PCR-t a Multiplex MX3000P kvantitatív RT-PCR rendszerrel (Stratagene, La Jolla, CA) végezzük. A kiindulási génexpressziót QRTPCR-rel határozzuk meg a GAPDH-hoz viszonyítva a delta-delta Ct (2-∆∆) módszerrel. A forward és a reverse primerek kiválasztása a primerbank szoftver alapján történik (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). A szöveteken belüli génexpresszió megerősítésére a korábbi vizsgálatokhoz hasonlóan immunhisztokémiát alkalmazunk.