En åben-label undersøgelse til at identificere molekylære markører for steroidresistens (MERK2)

Besøg 1: Baseline-evaluering og nasal endoskopi

Ved dette besøg vil hver forsøgsperson underskrive et informeret samtykke, forsøgspersonens berettigelse til undersøgelsen vil blive bekræftet, en sygehistorie vil blive indhentet, forsøgspersonen vil gennemgå en fysisk undersøgelse og nasal endoskopi. En uringraviditetstest vil blive udført på alle kvinder i den fødedygtige alder. NP-størrelse vil blive registreret ved hjælp af NP-scoringssystemet (se nedenfor).

Allergi hudtest vil kun blive udført, hvis det ikke er blevet udført inden for de seneste 3 år.

Besøg 2: Pre-treatment nasal polyp (NP) biopsier

Ved dette besøg vil hvert individ gennemgå NP-biopsier før behandling. Biopsierne vil blive indhentet af Dr. Eric Holbrook på Massachusetts Eye & Ear Infirmary, beliggende ved siden af ​​MGH.

Besøg 3: Påbegyndelse af behandling med MFNS

Ved dette besøg vil hver forsøgsperson få en næsespekulumundersøgelse for at bekræfte, at der ikke er nogen resterende blødning fra NP-biopsierne. Derefter vil forsøgspersonen få en 4 ugers forsyning af MFNS (Nasonex ®) og blive instrueret i at tage 2 sprays/næsebor BID. Forsøgspersonerne vil få en NP-symptomdagbog og instrueret i at registrere NP-symptomer dagligt i 4 uger.

Hvert forsøgsperson vil blive tildelt et unikt nummer (screenings- eller basisnummer) til identifikationsformål. En patient vil under ingen omstændigheder blive tildelt mere end ét tildelingsnummer. Nasonex-flaskerne vil blive udleveret fra MGH Research Pharmacy.

Besøg 4: NP-biopsi under behandling

Ved dette besøg vil hvert individ gennemgå NP-biopsier under behandling. Biopsierne vil blive indhentet af Dr. Eric Holbrook på Massachusetts Eye & Ear Infirmary, beliggende ved siden af ​​MGH. Forsøgspersonen vil blive bedt om at tilbageholde Nasonex-behandling i 48 timer efter denne biopsi.

Besøg 5: Post-biopsi-undersøgelse Ved dette besøg vil hver forsøgsperson få en næsespekulumundersøgelse for at bekræfte, at der ikke er nogen resterende blødning fra NP-biopsierne. Hvis blødningen er ophørt, vil forsøgspersonen genoptage Nasonex-behandlingen.

Besøg 5 6: Afsluttende besøg og nasal endoskopi

Ved dette besøg vil hver forsøgsperson returnere deres brugte og ubrugte flasker med Nasonex og indsende deres NP-symptomdagbog og gennemgå en nasal endoskopi. NP-størrelse vil blive registreret ved hjælp af NP-scoringssystemet (se nedenfor). Forsøgspersonerne vil også gennemføre en global vurdering af effektiviteten af ​​MFNS for deres NP-symptomer.

EKSPERIMENTELLE PROCEDURER:

Præ-biopsier eksplantationskulturer: vi vil få NP-biopsier til in vitro eksplantationskultur før steroidbehandling fra hver patient. Vi vil dyrke eksplantaterne i MF ved 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M og analysere inflammatorisk celleinfiltrat og steroidfølsomhed baseret på induktion af apoptose (aktiveret caspase-3-ekspression) i inflammatoriske celleundergrupper, alfa-glatte muskelcelle actin+ myofibroblaster og epitelceller. Hver betingelse vil blive udført i to eksemplarer, så en prøve kan behandles til IHC og en til mikroarray.

Eksplantationskulturer: NP-eksplantater vil blive dyrket i minimalt essentielt medium i 24 timer ved 37oC ved brug af fladbundede vævskulturplader. Efter 24 timer i kultur vil 1 eksplantat pr. betingelse blive behandlet til IHC og 1 til mikroarray. Vi vil også gemme kultursupernatant fra hver eksplantattilstand til bekræftelse af vigtige forskelle i proteinproduktion, baseret på data fra IHC og mikroarrays.

Immunhistokemi (IHC) og konfokal laserimmunfluorescensmikroskopi (CLM): Frosne NP-prøver fra SS-NP- og SR-NP-patienter før og efter MFNS-behandling vil blive analyseret ved immunfluorescens-konfokal lasermikroskopi (IF-CLM) for T-lymfocytter (CD3 og CD4) ), MBP+ eosinofiler, alfa-glat muskel actin (markør for aktiverede myofibroblaster, monoklonale, R&D Systems, Inc.) og spaltet caspase-3 (polyklonal, CST, Beverly, MA). Antallet af inflammatoriske celler af hver type og spaltede caspase-3 positive og negative celler af hver type vil blive talt af to observatører, der er blindet for behandling og rækkefølge for indsamling. En lignende kvantificering af epitelfarvning for PCNA (en markør for epithelcelleproliferation) og spaltet caspase-3 vil blive udført ved hjælp af semikvantitativ gradering af omfang og intensitet af farvning som i vores tidligere undersøgelser. Intensiteten og fordelingen af ​​immunfarvning vil blive kvantificeret på en semikvantitativ karakterskala på: 0 = fraværende farvning, 1 = mild diffus eller moderat pletvis farvning; 2 = moderat diffus farvning; 3 = intens diffus farvning i epitel, stroma og kirtler af 2 uafhængige observatører.

Histologisk steroid-sensitiv og steroid-resistent fænotype betegnelse: Udpegning af NP-personer som histologisk "steroid-sensitive" eller "steroid-resistente" vil være baseret på følgende mål før og 1 uge efter behandling med MFNS:

1. grad af reduktion i NP eosinofiler forbedring i NP inflammation,
2. omfanget af induktion af apoptose i eosinofiler, T-lymfocytter og epitelceller,
3. omfanget af undertrykkelse af inflammatorisk genekspression baseret på mikroarray-analyse.

Forsøgspersonerne vil blive rangeret i rækkefølge fra mest følsomme til mindst følsomme over for behandling. Lineær regression vil blive brugt til at undersøge sammenhænge mellem disse uafhængige kontinuerte variable.

Mikroarray-analyse: mikroarray-analyse vil blive brugt til at vurdere global gen-mRNA-ekspression og også indfange information om pro- og anti-apoptotisk genekspression i "steroidfølsomme" (SS-NP) og "steroidresistente" SR-NP-biopsier opnået før og 1. uge efter behandling med intranasal mometasonfuroat (MFNS). RNA-isolering til mikroarray udføres ved hjælp af Arcturus picopure RNA-isoleringssystem. Plast LCM-opsamlingshætter inkuberes ved 42oC i 30 minutter i 25 mikroliter af sættets GITC-holdige ekstraktionsbuffer, centrifugeres kort for at opsamle den ekstraherede opløsning og fryses derefter ved -80oC. Prøver optøs og samles før oprensning på picopure RNA-søjler, og genomisk DNA fjernes via RNAse-fri DNAse (Qiagen, Hilden, GmbH) fordøjelse på søjlerne. Totalt cellulære RNA'er fra hver søjle elueres i 11 mikroliter elueringsbuffer og anvendes til fremstilling af RNA-Seq-biblioteket eller omdannes til cDNA-til QRTPCR-assayet ved at bruge et 20 mikroliter totalt reaktionsvolumen via standard superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) protokol. Vi har også mikroarray-data fra 8 sunde kontrol-mellemturbinater opnået i en tidligere undersøgelse, der vil blive brugt til sammenligning af genekspression med nasale polypper.

RNA vil blive oprenset fra én NP-biopsi pr. patient ved hjælp af ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit, (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI), som inkluderer ScriptGuard™ RNase-hæmmer for at opretholde integriteten af ​​oprenset RNA. Oprenset RNA-kvalitet vil blive kontrolleret ved hjælp af RNA-nanoanalyse (Agilent Bioanalyzer, Quantum Analytics, Inc., Foster City, CA). Den nedre grænsefølsomhed er 200 pg/ml, hvilket giver os mulighed for at verificere kvaliteten af ​​RNA ekstraheret fra omkring 1250 celler.

QRTPCR: Gener, der udtrykkes differentielt ved RNA-ekspressionsprofilering, vil blive yderligere undersøgt ved kvantitativ realtids-RT-PCR fra en separat lille prøve af oprenset RNA fra hvert vævsrum. RT-PCR vil blive udført ved hjælp af Multiplex MX3000P kvantitative RT-PCR-system (Stratagene, La Jolla, CA). Baseline genekspression vil blive kvantificeret ved QRTPCR i forhold til GAPDH ved hjælp af delta-delta Ct (2-∆∆) metoden. Forward og reverse primere vil blive valgt baseret på primerbank software (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). For at bekræfte gen-ekspression i væv vil vi bruge immunhistokemi som i tidligere undersøgelser.