台湾常见肠杆菌科产超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL) 菌株的流行率

材料和方法

1. 细菌分离物的收集

   1998年起，国健研究院人员建立了分布于台湾各地的22至44家医院的耐药性长期监测。 1998年、2000年、2002年、2004年、2006年共进行了五次，分别命名为TSAR-I、TSAR-II、TSAR-III、TSAR-IV和TSAR-V。 在这项研究中，将招募来自 TSAR-IV 的肠杆菌科分离株。 大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌和摩氏摩根氏菌各 50 个分离株（约占 TSAR IV 收集的分离株的 10%）将被纳入以下微生物学研究。

   通过筛选试验将分离物分为产 ESBL 组或非产组。 通过常规方法将所有可用的分离物鉴定到种或属水平。 从同一个体患者身上回收的具有相同物种的分离株被认为是一个分离株。 在测试之前，所有分离株都储存在-70℃的胰蛋白酶大豆肉汤（Difco Laboratories, Detroit, MI）中，并补充了 15% 的甘油。

2. 数据采集

   为每个分离株收集的信息包括：收集日期、检测日期、身份、感染部位、患者的医院单位，以及分离株是否在社区获得（即，在入院后 48 小时内获得的标本）、患者的住院时长住院。 所有分离物对靶向抗菌剂的敏感性将由它们的最小抑制浓度（MIC 值）确定，遵循各自抗菌剂的 CLSI 断点。

3. 抗菌药敏试验

   • 接种物制备 无菌盐水（0.85% NaCl）、适合接种物制备的缓冲液或肉汤，具体取决于生物体。 应使用需氧菌和其他微生物的 CLSI 接种程序。 0.5 麦克法兰浊度将用作需氧菌的标准。
   • 接种 使用无菌环/拭子以获得最佳接种量悬浮液。 将整个琼脂表面擦拭 3 次；每次将板旋转约 90 度以确保接种物均匀分布。 让多余的水分吸收约 10-15 分钟，使表面完全干燥，然后再使用 E 测试条。
   • E试纸的应用在使用E试纸之前，确保接种的琼脂表面完全干燥。 使用 Etest 涂药器或使用镊子夹住条带的手柄（标记为 E）并将它们放在接种的琼脂表面上，确保 MIC 刻度朝上并且浓度最大值最接近边缘盘子。 确保整个条带与琼脂表面完全接触。 一旦应用，由于抗生素会立即释放到琼脂中，因此条带不能移动。 建议将 4-6 条不同的 E 测试条应用到 150 m 琼脂平板上。 本研究除厄他培南外，还将应用头孢吡肟、头孢吡肟加克拉维酸（用于鉴定产ESBL分离株）、环丙沙星、头孢美唑、阿米卡星、替加环素等六种抗菌药物的E试纸。
   • 孵育 孵育温度和使用的气氛必须最适合特定细菌种类和正在测试的抗生素的生长。 CLSI 对非苛求性需氧菌和兼性厌氧菌推荐 35℃/16-18 小时/环境大气。
   • MIC 读数 培养完成后，当细菌生长变得清晰可见时，读取抑制椭圆边缘与 E 试纸条交点处的 MIC 值。 使用 E 测试阅读指南和其他技术指南来正确阅读不同的模式。 将使用含有头孢吡肟（MIC 测试范围，0.25-16 mg/L）和头孢吡肟（MIC 测试范围，0.064-4 mg/L）加 4 mg/L 克拉维酸的试纸（AB Biodisk，Solna，瑞典）检测根据制造商的说明表达 ESBL。在克拉维酸存在下，MIC 减少 ≥ 3 倍稀释是 ESBL 产生的指标。 即使 MIC 比率 <8 或无法读取，椭圆变形或“幻影”区的存在也是 ESBL 生产的指标。
   • 质量控制 为了检查系统的正确处理、质量以及材料和方法的一致性，使用相关抗生素测试质量控制菌株。 肺炎链球菌和流感嗜血杆菌可在环境温育下通过微量肉汤稀释法测定。 以下生物作为对照菌株包括在内：金黄色葡萄球菌 ATCC 29213、粪肠球菌 ATCC 29212、肺炎链球菌 ATCC 49619、大肠杆菌 ATCC 25922、大肠杆菌 ATCC 35218、肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 和铜绿假单胞菌 ATCC 27853。 每进行 500 次 Etest，将进行一次包含上述 5 种对照菌株的对照试验。
   • 分子研究 表达 ESBL 的分离物将使用脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 方法进一步分型。 PFGE 的详细程序和 PFGE 条带模式的解释如我们之前的报告 (13) 中所述。

数据分析

根据 CLSI 提供的指南，分离株分为易感、中间和耐药。 对抗菌剂中间或耐药的分离株也被归类为对药物不敏感。 根据分离株的不同感染部位和来源，分析主要致病菌的不敏感率。 将分析地理区域、从中获得这些分离株的医院类型之间的关联，以对抗抗菌药敏感性。